Study of the nerve terminal regeneration in neuromuscular junction intoxicated with different presynaptic neurotoxins.

The neuromuscular junction (NMJ) is a fundamental structure in biology and its organization have been complicated by the addiction of perisynaptic Schwann cells (PSCs), leading to the tripartite system concept. PSCs are the glia of the NMJ and they are implicated in its recovery after damage. Indeed, PSCs dedifferentiate upon nerve terminal (NT) damage, remove NT debries and protrude prolongations to guide reinnervation. Some PSCs activation mediators have been found (ATP, ACh) but we hypothesized that also arachidonic acid and its derivates could lead to PSCs activation. Nerve damage models used till now provide a non controllable system since they lead to Wallerian degeneration, a degenerative/inflammatory process. The intramuscular injection of presynaptic neurotoxins (α-LTX and SPANs), provoking damage limited to the NTs, represents our experimental model. Since SPANs leads to NTs degeneration via different action, to unravel Ca2+ influx relative contribution we performed a side-by-side comparison with α-LTX, which provoke degeneration through massive Ca2+ influx. All analyzed parameters are similar for the two neurotoxin classes. This indicates that Ca2+ overloading plays a major role in NTs degeneration induced by SPANs. No differences were observed in NTs degeneration/regeneration kinetic between fast (EDL) and slow muscle (soleus). α-LTX provoke a synchronous degeneration of NTs in agreement with muscle functional assay (DAS assay). NTs degeneration induced by a SPAN such as βBtx present a “patch-like” pattern and DAS score do not parallels immunohistological observations. A difference in PSCs behaviour was observed between α-LTX-injected and denervated EDL. A decrease in signal intensity of S100-labeled PSCs was observed after α-Ltx treatment, indicating their activation, but no prolongations were observed except in denervated sample. To characterize PSCs behavior we extended the analysis to Nestin and Glial Fibrillaric Acidic Protein (GFAP), that label only activated PSCs. No differences between control and intoxicated NTs were observed. Considering that PSCs acquire macrophagic-like activity and possess receptors sensing pathogen-associated molecular patterns we wondered if formylated peptides and mitochondrial DNA, coming from degenerating mitochondria, could activate PSCs. We tried to address this question on Schwann Cells primary culture with different approaches but, up to now, the results are not conclusive due to experimental problems.La giunzione neuromuscolare (GNM) e’ una struttura fondamentale in biologia e la sua organizzazione e’ stata recentemente complicata dall’ aggiunta delle cellule di Schwann perisinaptiche (CSP), portando al concetto di sistema tripartito. Le CSP rappresentano la glia della GNM e sono coinvolte nel suo recupero in seguito a danno. Infatti, le CSP dedifferenziano in seguito a danno al terminale nervoso (TN), rimuovono i detriti derivanti della sua degenerazione e protrudono una serie di prolungamenti che guidano la reinnervazione. Alcuni mediatori implicati nell’attivazione dell CSP sono stati individuati (es. ATP, ACh) ma noi ipotizziamo che anche l’acido arachidonico e I suoi derivati possano portare all’attivazione dell CSP. I modelli di danno al nervo usati fino ad ora forniscono un sistema non controllabile dal momento che portano alla degenerazione Walleriana, un processo degenerativo e infiammatorio. L’iniezione intramuscolare di tossine presinaptiche (α-LTX and SPANs), provocando un danno limitato al solo TN, rappresenta il nostro sistema sperimentale. Dal momento che le SPANs conducono alla degenerazione del TN mediante differenti azioni, per determinare il contributo relativo dell’influsso di Ca2+ abbiamo effettuato una comparazione con α-LTX, la quale provoca degenerazione del TN attraverso un massiccio ingresso di Ca2+. Tutti I parametri analizzati sono simili per le due classi di neurotossine. Questo indica che il sovraccarico di Ca2+ gioca un ruolo di rilievo nella degenerazione del TN indotta da SPANs. Non sono state osservate differenze nella cinetica di degenerazione/rigenerazione dei TN tra muscoli veloci (EDL) e lenti (soleo). α-LTX provoca una degenerazione sincrona in completo accordo con i dati derivanti dal saggio di funzionalita’ muscolare (saggio DAS). La degenerazione dei TN indotta da SPANs, nel caso specifico βBtx, presentano un motivo a chiazze e i dati derivati dal saggio DAS non correlano con le osservazioni immunoistologiche. Una differenza nel comportamento delle CSP e’ stato osservato tra EDL iniettati con α-LTX e denervati. Una diminuzione dell’intensita’ del segnale delle CSP marcate con S100 e’ stato osservata dopo trattamento con α-Ltx e denervazione, indicandone l’attivazione, ma non e’ stata osservata la protrusione di prolungamenti se non nei muscoli denervati. Al fine di caratterizzare meglio questo peculiare comportamento dell CSP, abbiamo esteso l’analisi ad marker di attivazione delle CSP, quali Nestina and Glial Fibrillaric Acidic Protein (GFAP). Non sono state osservate differenze tra i controlli e i campioni intossicati. Considerando che le CSP acquisiscono un’attivita’ simil-macrofagica in seguito ad attivazione e possiedono recettori in grado di individuare pattern molecolari associati a patogeni, ci siamo chiesti se peptidi formilati e DNA mitocondriale, derivanti dai mitocondri in degenerazione, possano attivare le CSP. Abbiamo provato a testare con diversi approcci la nostra ipotesi su colture primarie di cellule di Schwann ma, a causa di problemi sperimentali, i risultati non sono al momento conclusivi