Microbiological approaches to reduce the sulphite addition in oenology

Sulphite is widely used in winemaking for its antimicrobial and antioxidant properties, although its toxic effect on human health is proven. For this reason strategies for reducing chemical preservatives in winemaking is strongly demanded. Wine yeasts can cope with SO2 by different systems, such as acetaldehyde and S-amino acids production or SO2 export. In this study a first screening of SO2 resistance and on plate production of SO2 and H2S have been performed for autochthonous strains, isolated in Veneto vineyards to be used as starter of fermentation in the production of Prosecco di Valdobbiadene DOCG and DOC Piave wines, compared to commercial strains. Then the oenological characteristics of 11 S. cerevisiae strains of have been evaluated. These strains are 4 autochthonous strains isolated during local selection projects in DOCG Conegliano - Valdobbiadene and DOC Piave areas, together with 6 commercial strains, which genome have been recently sequenced, and relative informations are available in the principal genomic databases, and the laboratory strain S288c, the first one that has been sequenced. Main technology and quality characters have been evaluated to determine the suitability of strains for winemaking process. In particular have been studied the production of ethanol and glycerol, the glucose consumption at 2 and 7 days, the production of hydrogen sulphide, acetaldehyde and sulphur dioxide and the resistance to various concentrations of free sulphur dioxide in synthetic must. Sulphite response in yeast has been investigated in order to elucidate factors that affect sulphite production during vinification. Moreover acetaldehyde, another compound produced by yeast, linked with sulphite metabolism or detoxification, has been analysed since it affects wine quality. Genetic characteristics identified after genome sequencing of 4 autochthonous strains (2 from Prosecco area and 2 from Raboso area), such as oenological SNPs, strain-specific genes and important translocations, have been analyzed in Real-time PCR for a large number of autochthonous strains. Then the behaviour towards sulphite of 4 wine yeasts has been investigated, and transcriptome analysis during fermentation has been performed by means of next generation sequencing. For all strains, fermentation rate was monitored together with sulphite production in synthetic must supplemented with different doses of SO2 (0 mg/l and 25 mg/l). Finally, a selection of reference genes for Real-time PCR has been made, and a set of genes suitable for such conditions has been identified. Results point out the importance of verifying strain attitudes towards sulphite at different sulphite concentrations. This study tries to clarify the complex regulative mechanisms of sulphites during fermentation, thus giving new guidelines for critic control of these fermentation parameters in order to maximize effect of sulphite added thus limiting the dose employed during vinification.I solfiti sono ampiamente utilizzati nella vinificazione per le loro proprietà antimicrobiche e antiossidanti, sebbene il loro effetto tossico sulla salute umana sia dimostrato. Per questo motivo le strategie di riduzione dei conservanti chimici nel processo di vinificazione è fortemente richiesto. I lieviti possono rispondere alla presenza di SO2 con sistemi diversi, come la produzione di acetaldeide e ammino acidi solforati o l’esporto di SO2. In questo studio è stato fatto un primo screening sulla resistenza alla SO2 e sulla produzione di SO2 e H2S in piastra da parte di ceppi autoctoni, isolati nei vigneti del Veneto per essere utilizzato come starter di fermentazione nella produzione di Prosecco di Valdobbiadene DOCG e Vini del Piave DOC, confrontati con dei ceppi commerciali. Inoltre sono state valutate le caratteristiche enologiche di 11 ceppi di S. cerevisiae. I ceppi in esame sono 4 ceppi autoctoni isolati durante i progetti di selezione locale nelle aree Conegliano - Valdobbiadene DOCG e Piave DOC, insieme con 6 ceppi commerciali, il cui genoma è stato recentemente sequenziato, e le informazioni relative sono disponibili nelle banche dati genomiche principali, e il ceppo di laboratorio S288c , il primo che è stato sequenziato. I principali caratteri tecnologici e di qualità sono stati valutati per determinare l'idoneità dei ceppi alla vinificazione. In particolare, sono state studiate la produzione di etanolo e glicerolo, il consumo di glucosio a 2 e 7 giorni, la produzione di idrogeno solforato, acetaldeide e biossido di zolfo e la resistenza a varie concentrazioni di biossido di zolfo libero in mosto sintetico. La risposta ai solfiti nel lievito è stata studiata al fine di chiarire i fattori che influenzano la produzione dei solfiti durante la vinificazione. Inoltre l’acetaldeide, un altro composto prodotto da lievito, collegato con il metabolismo solfito o disintossicazione, è stata analizzata in quanto influisce sulla qualità del vino. Con il sequenziamento del genoma di 4 ceppi autoctoni (2 da zona del Prosecco e 2 dalla zona Raboso) è stato possibile individuare delle caratteristiche genetiche, come ad esempio SNPs enologiche, geni ceppo-specifici e traslocazioni importanti, che sono stati analizzati in Real-time PCR per un gran numero di ceppi autoctoni . Inoltre il comportamento di 4 lieviti enologici nei confronti dei solfiti è stato studiato, ed è stata effettuata l'analisi del trascrittoma durante la fermentazione per mezzo di next generation sequencing. Per tutti i ceppi la velocità di fermentazione è stata monitorata, insieme alla produzione di SO2, in mosto sintetico con differenti dosi di SO2 (0 mg / l e 25 mg / l). Infine, è stata fatta una selezione di geni reference da usare in Real-time PCR, e una serie di geni adatti a queste condizioni è stato identificato. I risultati sottolineano l'importanza di verificare l'atteggiamento del ceppo nei confronti dei solfiti a diverse concentrazioni di SO2. Questo studio cerca di chiarire i complessi meccanismi di regolazione dei solfiti durante la fermentazione, dando così nuove linee guida per il controllo critico di questi parametri di fermentazione, al fine di massimizzare l'effetto dei solfiti aggiunto limitando in tal modo la dose impiegata durante la vinificazione