Development of lentiviral vectors expressing multiple small interfering RNAs as a gene therapy approach against HIV-1 infection

The advent of combinatorial antiretroviral therapy proved to be highly effective in controlling HIV-1 disease progression, transforming AIDS from a deadly to a chronic condition. However, major current issues are systemic drug toxicity, generation of drug resistant viral mutants and persistence of a latent viral reservoir. In addition, drug-based regimens require daily intake and many patients cannot maintain the high level of adherence necessary for viral control. Given the limitations of the current therapeutic approaches and the absence of any effective vaccination strategy against HIV-1 infection, there is a pressing need to develop a curative treatment. The first reported cure of HIV-1 infection was provided by the apparent eradication of the virus in a patient transplanted with hematopoietic stem cells (HSCs) from a donor lacking the functional CCR5 co-receptor, which is used by most HIV-1 strains to enter target cells. However, while an important proof-of-principle, few individuals could benefit from such procedure due to toxicities of allogeneic rejection and limitations of finding compatible CCR5-negative donors. Therefore, gene therapy approaches aimed to modify autologous HSCs in order to render them resistant to HIV-1 infection have emerged as a promising direction. If successfully engrafted, these cells would offer continuous, long-term production of virus-resistant immune cells. To this end, several anti-HIV-1 genes have been developed and tested both in preclinical and clinical settings and, among these, RNA interference (RNAi)-based approaches represent one of the most powerful tools. Starting from these considerations, this study was aimed to develop lentiviral vectors expressing anti-HIV-1 RNAi triggers and to test their efficacy in relevant human primary cells for HIV-1 infection, including CD4+ T lymphocytes and macrophages. The final goal of the research project is to use the most effective and safe vector(s) to genetically modify HSCs harvested from AIDS-related lymphoma (ARL) patients, that offer a unique opportunity to evaluate anti-HIV-1 gene therapy strategies in an ethically acceptable clinical setting, as they often undergo HSC transplantation. To account for HIV-1 variability, we selected multiple RNAi triggers, including a short hairpin RNA (shRNA), generating one single small interfering RNA (siRNA) against either the CCR5 cellular gene (shCCR5) or the vif viral gene (shvif), and a long hairpin RNA, giving rise to two different siRNAs against the viral tat and rev overlapping first exons (lhtat/rev). Overall these molecules inhibit different steps of the HIV-1 life cycle, including entry into target cells (shCCR5), gene expression (lhtat/rev) and infectivity of the newly produced particles (shvif). In the first part of the work, we constructed vectors expressing the shCCR5, the shvif or the lhtat/rev as a single transcriptional unit under the control of different human polymerase III promoters (i.e. U6, 7SK or H1). These vectors allowed us to investigate promoter influence on the siRNA silencing activity, finding out the best combination of promoter-RNAi trigger for the development of a combinatorial antiviral approach. As a next step, we obtained combinatorial vectors simultaneously expressing the above described siRNAs, as independent transcriptional units within the same vector backbone. To optimize vector design, a number of different vectors were developed by using either the same or distinct promoters driving the expression of each RNAi trigger. Moreover, the transcriptional units were cloned in different position with respect to each other within the vector framework. Considering that the use of multiple highly active RNA polymerase III promoters can potentially saturate the endogenous microRNA biogenesis pathway, we also explored an alternative combinatorial strategy, based on the use of an extended shRNA (e-shRNA). This molecule simultaneously expresses the three siRNAs targeting the CCR5, the vif and the tat/rev transcripts, under the control of the U6, the 7SK or the H1 promoter. When comparing the antiviral activity of all the different combinatorial platforms, we could identify two vectors (i.e. U6shCCR5-7SKshvif-H1lhtat/rev and H1e-shRNA) conferring highly potent protection against HIV-1 infection in both cell lines and human primary cells, in the absence of cytotoxicity. Overall, our findings highlighted some important strengths and pitfalls of different approaches used for multiple siRNAs delivery, providing valuable insights for the design and application of reliable combinatorial RNAi to counteract HIV-1 replication. In addition, this study contributed to the identification of new anti-HIV-1 combinatorial platforms that, once shown to be effective and safe in vivo, may be next in line for clinical testing.Nonostante l’impiego di associazioni di farmaci nel corso dell’infezione da HIV-1 determini una riduzione della carica virale e ritardi la progressione della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), la tossicità dei farmaci, la comparsa di virus resistenti e la persistenza del virus in specifici compartimenti anatomici e cellulari rappresentano una sfida per il controllo a lungo termine dell’infezione. In tale contesto si inserisce il crescente interesse della comunità scientifica allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Il primo importante successo nella cura dell’infezione da HIV-1 è stato ottenuto in seguito al trapianto allogenico, in un paziente leucemico HIV positivo, di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) naturalmente resistenti all’infezione a causa di una mutazione a livello del corecettore virale CCR5. Tuttavia, il potenziale rischio di rigetto e la difficoltà di reperire donatori compatibili, non consentono l’adozione diffusa di questo approccio. Il risultato ottenuto supporta, invece, l’idea che la modificazione genetica delle HSC, che rappresentano i precursori di tutte le cellule coinvolte nella patogenesi dell’infezione da parte di HIV-1, possa generare un sistema immunitario permanentemente resistente al virus. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi approcci di terapia genica finalizzati all’espressione di geni anti-HIV-1 nelle HSC. Tra questi, gli approcci basati sulla tecnica dell’RNA interference (RNAi) rappresentano un potente strumento in grado di inibire la replicazione virale. Partendo da questi presupposti, lo scopo del presente studio consiste nello sviluppo di vettori lentivirali esprimenti small interfering RNA (siRNA) in grado di inibire la replicazione di HIV-1 e di testarne l’efficacia in cellule primarie umane fisiologicamente rilevanti per l’infezione virale, tra cui macrofagi e linfociti T CD4+. L’obiettivo ultimo del più ampio progetto di ricerca, in cui si inserisce questo lavoro, è l’impiego dei vettori antivirali più efficaci per la manipolazione genetica di HSC derivanti da pazienti HIV positivi affetti da linfoma. Questi pazienti rappresentano, infatti, un’opportunità unica per valutare una terapia anti-HIV-1 basata sull’impiego di HSC ingegnerizzate in un contesto clinico eticamente accettabile, poichè sono spesso sottoposti a trapianto di HSC. A causa dell’elevato tasso di mutazione associato alla replicazione di HIV-1, sono necessarie strategie terapeutiche combinatorie al fine di ridurre il rischio di insorgenza di resistenze. Pertanto, sono state selezionate le seguenti molecole in grado di inibire diverse fasi del ciclo biologico virale: due short hairpin RNA, codificanti un singolo siRNA diretto contro il trascritto del gene cellulare CCR5 (shCCR5) o del gene virale vif (shvif) e una long hairpin RNA, codificante due siRNA diretti contro il trascritto comune del primo esone dei geni virali tat e rev (lhtat/rev). Nella prima parte del lavoro, sono stati ottenuti vettori codificanti le singole unità trascrizionali esprimenti shCCR5, shvif e lhtat/rev sotto il controllo di diversi promotori umani della polimerasi III, tra i quali U6, 7SK e H1. È stata, quindi, valutata l’attività di silenziamento genico dei singoli siRNA, allo scopo di identificare la migliore combinazione di promotore-siRNA per il successivo sviluppo di approcci antivirali combinatori. In seguito, gli siRNA sopradescritti sono stati clonati tutti all’interno di uno stesso vettore sottoforma di unità trascrizionali indipendenti. In particolare, al fine di ottimizzare il design dei vettori, sono state ottenute multiple piattaforme combinatorie, che differiscono l’una dall’altra per i promotori che guidano l’espressione degli siRNA e per la posizione delle unità trascrizionali. Poiché la presenza di promotori multipli potrebbe causare la saturazione del pathway cellulare di biogenesi dei microRNA, è stata sviluppata una strategia combinatoria alternativa, basata sull’impiego di extended shRNA (e-shRNA). Questa molecola è in grado di esprimere sotto il controllo di un singolo promotore i tre siRNA contro i trascritti dei geni CCR5, vif e tat/rev. Lo studio dell’attività antivirale delle diverse piattaforme combinatorie ha portato all’identificazione di due vettori (U6shCCR5-7SKshvif-H1lhtat/rev e H1e-shRNA) in grado di inibire efficientemente la replicazione di HIV-1 sia in linee cellulari, che in cellule primarie umane, in assenza di citotossicità. Nel complesso, i risultati ottenuti evidenziano aspetti importanti che devono essere presi in considerazione per lo sviluppo di approcci combinatori basati su RNAi finalizzati all’inibizione della replicazione di HIV-1. Il presente studio ha portato, inoltre, all’identificazione di nuove piattaforme combinatorie anti-HIV-1 che potrebbero essere testate in futuri studi clinici, una volta accertata la loro efficacia e sicurezza in vivo nel modello animale