Lack of Protein Kinase C alpha is associated with poor prognosis in pediatric T-ALL: a phosphoproteomic discovery

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), the most common pediatric cancer, is an aggressive malignancy of lymphopoietic cells characterized by a clonal proliferation of blast cells originated from lymphoid precursors arrested at early stages of differentiation. Nowadays the introduction of risk-directed treatment and intensified cure protocols has improved the outcome of ALL pediatric patients. Although current therapies achieve five-year event-free survival rate of about 80% in children, the rest of patients experience treatment resistance and risk of early relapse. In order to develop new additional therapeutic supports and to assemble specific and personalized therapies, improving drug response and reducing drug toxicity, it is extremely important to identify novel therapeutic targets and new prognostic biomarkers on leukemic cells. To pursue this aim, Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) approach represents a powerful tool to profile protein pathways in order to identify novel diagnostic and prognostic biomarkers. RPPA can measure the activation levels/phosphorylation of large numbers of signalling proteins from small clinical samples in a very reproducible, precise, sensitive and high-throughput manner. The identification of critical nodes or interactions within the protein network is a potential starting point for drug development and/or design of individual therapy regimens. In RPPA, protein lysates are immobilized on a nitrocellulose-coated glass slide. Each group of spots represents an individual test sample, such that an array is comprised of multiple, different samples. Each RPPA slide is probed with a single detection molecule (one slide = one antibody) and a single analyte is concurrently measured across multiple samples. This format allows multiple samples to be analyzed under the same experimental conditions for any given analyte. This approach facilitates comparisons between samples, since experimental variability is eliminated. During my PhD research I applied the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) technique to the study of patients affected by Acute Leukemia. The principal aim of this research was the discovery of new candidate biomarkers and therapeutic targets involved in the leukemic process through the study of the phosphoproteomic profiles of ALL pediatric patients (T-ALL and B-ALL) by means of the RPPA technique. In the study of pediatric T-ALL at diagnosis reported in the “Main Topic”, we identified PKC alpha as a new prognostic marker of relapse. This promising protein kinase has been identified through a retrospective RPPA screening of fifty-three different proteins/phophoproteins in 98 T-ALL specimens. PKC alpha resulted to be downregulated in the group of patients with a higher incidence of relapse. We showed that low PKC alpha activation is a consequence of a low PKC alpha "gene expression" Moreover, we induced PKC alpha inhibition in T-ALL cell lines using a PKC alpha commercial inhibitor and an increase in proliferation rate was detected. RPPA thus proved to be a useful approach to discover new molecules aberrantly expressed in leukemia pathways. The identification of players involved in malignant mechanisms allows focusing on novel prognostic factors: PKC alpha resulted to be a promising marker of risk of relapse in pediatric T-ALL. A study of PKC alpha expression in a larger T-ALL patients cohort should confirm this relevant data and to propose PKC alpha as a new prognostic marker for T-ALL patients stratification. In the pediatric B-cell precursor (BCP)-ALL study we used RPPA to map in 118 pediatric BCP-ALL patients for the expression/activation of 92 different proteins/phophoproteins part of key signalling “hubs”. Correlation of signalling activation with clinical response and known genetic information enabled us to identify new protein pathway biomarkers that, when validated in larger clinical sets, could be used for patients stratification and targeted therapy trials. In detail, we observed an increased activation/expression of several pathways involved in cell proliferation in patients with a clinical poor phenotype. First, MLL-rearranged leukemia revealed BCL-2 hyperphosphorylation caused by AMPK activation, indicating that AMPK could be responsible of apoptosis inhibition in MLL-rearranged patients and thus could be considered as a new potential therapeutic target. Second, in patients with poor clinical response to Prednisone we observed the up-modulation of LCK activity with respect to patients with good response. This tyrosine-kinase can be down-modulated with clinically used inhibitors that could be considered for further studies as a new additional therapy for Prednisone-resistant patients. Further we also found an association between high levels of CYCLIN E and relapse incidence. Moreover, CYCLIN E is more expressed in patients with early relapsed, who usually show an unfavourable prognosis. We decided to explore in deep the functional significance of AMPK activation in MLL-rearranged patients. We showed that the AMPK pathway contributes directly to the survival of MLL-rearranged BCP-ALL cells and AMPK can be considered a new druggable target in MLL-rearranged leukemias. RPPA reliability in detection of novel targets and markers has been demonstrated also in collaborative studies with national and international research groups, regarding also adult diseases such as Acute Myeloid Leukemia. In my PhD research I showed that the application of Reverse Phase Protein Arrays is a reliable, sensitive and high-throughput method to identify new aberrant molecular players involved in haematological malignancies. These findings will be useful in order to discover novel prognostic markers and therapeutic targets to propose for the development of more effective patient-tailored treatmentsLa Leucemia Linfoblastica Acuta (LAL), la forma di tumore pediatrico più diffusa, è una patologia delle cellule linfopoietiche caratterizzata da una proliferazione clonale dei blasti originati dai precursori linfoidi bloccati a stati differenziativi precoci. Ad oggi l’introduzione di trattamenti differenziati sulla base del rischio di ricaduta e di protocolli di cura più intensi ha portato ad un miglioramento della prognosi dei pazienti affetti da LAL. Anche se le terapie attualmente usate permettono di ottenere una sopravvivenza dell’80% a 5 anni dalla diagnosi, un paziente ogni cinque presenta resistenza alla terapia e rischio di ricaduta precoce. E’ dunque fondamentale identificare nuovi target terapeutici e nuovi biomarcatori delle cellule leucemiche al fine di sviluppare nuovi trattamenti di supporto e di individuare cure più specifiche, migliorando la risposta alle terapie e riducendo la loro tossicità. Per perseguire tale obiettivo, l’approccio sperimentale dei Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) rappresenta un potente mezzo per studiare il profilo proteico delle vie di trasduzione del segnale con lo scopo di identificare nuovi marker prognostici o target terapeutici. Con la metodica degli RPPA è possibile misurare il livello di attivazione/espressione di un ampio numero di fosfoproteine/proteine partendo da limitate quantità di campione in maniera riproducibile, precisa, sensibile e high througput. L’identificazione di alterazioni nei punti chiave dei network delle cellule tumorali rappresenta un potenziale punto di partenza per lo sviluppo di nuovi farmaci o l’ideazione di nuovi regimi terapeutici. Nel metodo degli RPPA, il proteoma di un set di campioni viene immobilizzato su un vetrino ricoperto di nitrocellulosa. Ciascun gruppo di spot rappresenta un signolo campione in analisi e nello stesso vetrino è possibile studiare simultaneamente fino a cento campioni. Ciascun vetrino viene poi marcato con un anticorpo: in tal modo ogni singolo analita viene sottoposto alle stesse condizioni di marcatura e tale riduzione nella variabilità sperimentale facilita il confronto tra diversi campioni. Durante il mio dottorato di ricerca ho applicato la tecnica dei Reverse Phase Protein Arrays allo studio delle Leucemie Acute. Lo scopo principale della mia ricerca è stata la scoperta di nuovi biomarcatori e target terapeutici coinvolti nel processo leucemico mediante lo studio del profilo fosfoproteomico nei pazienti pediatrici affetti da LAL (LAL-T e LAL-B). Nel “Main Topic” veine descritto lo studio dei pazienti pediatrici affetti da LAL-T in cui si identifica PKC alpha come nuovo fattore prognostico di ricaduta. Questa kinasi è stata individuata mediante lo screening retrospettivo di 98 pazienti all’esordio di LAL-T, in cui 53 diverse proteine o fosfoproteine sono state analizzate con la tecnica degli RPPA. PKC alpha è risultata downregolata nel gruppo di pazienti LAL-T con maggiore incidenza di ricaduta. La minore attivazione di PKC alpha è risultata conseguenza di una bassa espressione genica di PKC alpha inoltre, inibendo PKC alpha in linee cellulari LAL-T mediante l’utilizzo di un inibitore commerciale di PKC alpha si è riscontrato un aumento della proliferazione. La metodica degli RPPA si è dimostrata essere un efficace approccio per la scoperta di molecole aberranti nelle vie di traduzione del segnale in cellule leucemiche. L’identificazione delle proteine coinvolte nei meccanismi tumorali mette in luce nuovi fattori prognostici: PKC alpha è risultata un promettente marcatore di rischio di ricaduta nelle LAL-T pediatriche. Lo studio dell’espressione di PKC alpha in una coorte allargata di pazienti LAL-T permetterà di confermare questo importante dato e di proporre PKC alpha come nuovo fattore prognostico nella stratificazione dei pazienti pediatrici affetti da LAL-T. Nello studio delle LAL-B pediatriche, gli RPPA sono stati utilizzati per analizzare l’espressione/attivazione di 92 proteine/fosfoproteine in 118 pazienti affetti da LAL-B. Correlando le informazioni sulle vie di trasduzione attivate con la risposta alla terapia e con le caratteristiche genetiche dei pazienti, è stato possibile identificare nuovi biomarcatori che, una volta validati in un gruppo allargato di campioni LAL-B, potranno permettere una migliore stratificazione dei pazienti e potranno essere usati come nuovi target terapeuti per lo sviluppo di cure più efficienti. In particolare, nei pazienti a prognosi infausta si è osservato un aumento nell’attivazione/espressione di alcune vie di trasduzione del segnale coinvolte nella proliferazione cellulare. In primo luogo, i pazienti con traslocazione gel gene MLL presentano l’iperfosforialzione di BCL-2 come conseguenza dell’attivaizone di AMPK, suggerendo un ruolo di AMPK nell’inibizione dell’apoptosi. AMPK potrebbe dunque essere un nuovo potenziale target terapeutico. Il secondo risultato ha evidenziato una up-modulazione dell’attività di LCK nei pazienti con scarsa risposta al trattamento con Prednisone. Questa tirosina-kinasi potrebbe essere down-modulata mediante l’utilizzo di inibitori usati in clinica. Studi ulteriori approfondiranno questo dato al fine di identificare una terapia più adatta ai pazienti resistenti al Prednisone. Da questo studio è inoltre emersa un’associazione tra gli alti livelli di CICLINA E e l’incidenza di ricaduta. La CICLINA E è inoltre risutata maggiormente espressa nei pazienti ricaduti precocemente, generalmente associati a una prognosi infausta. E’ stato successivamente approfondito il significato funzionale dell’attivazione di AMPK nei pazienti MLL riarrangiati ed il pathway di AMPK è risultato coinvolto in modo diretto alla sopravvivenza delle cellule LAL-B riarrangiate per MLL. Tale dato suggerisce AMPK come nuovo target terapeutico per la cura di questo tipo di leucemia. L’affidabilità degli RPPA nell’identificare nuovi target e biomarcatori è stata riscontrata inoltre nell’ambito di progetti sviluppati in collaborazione con gruppi di ricerca nazionali e internazionali, tra cui lo studio delle Leucemie Mieloidi Acute nell’adulto. Nel mio corso di dottorato ho potuto riscontrare che il metodo dei Reverse Phase Protein Arrays è una tecnologia sensibile, affidabile e high throughput mediante la quale è possibile identificare nuove molecole aberranti coinvolte nelle patologie ematopoietiche. Questi risultati potranno portare alla scoperta di nuovi marcatori prognostici e di target terapeutici per lo sviluppo di cure più specifiche ed efficient