Biotechnology applications in sugar beet breeding

The aim of this thesis was to identify molecular markers associated to tolerance to biotic and abiotic stresses in sugar beet. Sugar beet is one of the world’s most important crops currently supplying around 20% of the sugar consumed worldwide. The crop is damaged by many adverse environmental conditions and the development of varieties that require fewer technical inputs for cultivation is one of the main research demands. To achieve this, sugar beet breeding is focusing on genetic improvement programs assisted by molecular markers. These methods are making selection procedures more rapid, accurate and less expensive. The development of a large set of SNP markers can facilitate the identification and exploitation of genes affecting important traits, such as resistance to biotic and abiotic stresses. Several techniques are used to enable SNP marker discovery in plants. Among these, the Restriction-site Associated DNA (RAD) technique is widely used. The RAD technique is based on acquiring and characterizing the genomic regions adjacent to a set of specific restriction enzyme recognition sites. Bulk Segregant Analysis (BSA) is a method to identify DNA markers linked to genes or genomic regions of interest. DNA samples from individuals showing contrasting phenotype are compared with a large set of molecular markers to select those linked to the trait of interest. The first part of the thesis presents a panel of 192 SNPs for effective sugar beet genetic diversity assessment using a recently released platform (QuantStudio 12K Flex system coupled with Taqman OpenArray technology) that has key elements required for high-throughput SNP genotyping. In the second part, the 192 SNPs were used to assess the phylogenetic relationship between Rizor and Holly (Rz1) resistance sources. The molecular results demonstrate that the resistances to rhizomania used by farmers over the last 30 years derived from sea beet collected in the Po River Delta. Analysis of molecular variance and principal coordinate analysis confirmed that Rizor and Rz1 couldn’t be distinguished as separate sources of resistance. In the third part, a marker linked to the first nematode tolerance gene (HsBvm-1) from Beta vulgaris ssp. maritima valuable for high-throughput marker-assisted selection was identified and mapped on chromosome 5. The fourth and fifth parts focus on resistance to abiotic stresses that compromise sugar production. Premature flowering or bolting, due to cold temperatures in early spring, is an undesirable characteristic that causes severe sugar yield losses and interferes with harvesting. A new locus involved in the genetic determination of bolting tendency was studied and a SNP marker associated with bolting tendency was found on chromosome 6. SNP location on the sugar beet genome confirms the association with flowering since it was mapped in a matrix metalloproteinase gene that causes late flowering and early senescence in Arabidopsis thaliana. Given the close and positive relationships between yield and root morpho-physiological traits, a BSA was conducted to identify a SNP marker linked to root elongation rate in sugar beet. SNP10139 was mapped on the peptide transporter gene influencing root elongation in Arabidopsis thaliana. The result suggests that SNPs developed in these studies could serve as a source for genotyping of sugar beet parental lines and varieties, with relevant impact on breeding program decisions.Lo scopo della tesi è stato quello di identificare marcatori molecolari associati alla tolleranza a stress biotici e abiotici in barbabietola da zucchero. La barbabietola attualmente produce circa il 20% dello zucchero mondiale. Uno dei maggiori obiettivi del miglioramento genetico è lo sviluppo di varietà che richiedano un sempre più basso utilizzo di mezzi tecnici per la coltivazione. Per raggiungere questo scopo, il breeding della barbabietola si è focalizzato su programmi di miglioramento genetico assistito da marcatori molecolari. Queste tecniche stanno rendendo la procedura di selezione più rapida, precisa e meno costosa. Lo sviluppo di un ampio set di marcatori SNP (Single Nucleotide Polymorphism) può facilitare l’identificazione e l’utilizzo di geni che controllano caratteri importanti di resistenza agli stress biotici e abiotici. Molte sono le tecniche che vengono utilizzate per lo sviluppo di marcatori SNP nelle piante. Fra queste, la tecnica Restriction-site Associated DNA (RAD), impiegata nel presente lavoro di tesi, è ampiamente diffusa e si basa sull'acquisizione e la caratterizzazione di regioni genomiche adiacenti a siti di restrizione riconosciuti da specifici enzimi. E’ stata utilizzata anche l’analisi dei segreganti riuniti (BSA) per identificare marcatori del DNA legati a geni o a regioni genomiche di interesse. Nella prima parte della tesi è stato messo a punto un set di 192 SNP per la genotipizzazione ad alta processività di accessioni di barbabietola utilizzando una recente piattaforma (QuantStudio 12K Flex system) rilasciata da Life Technologies, Inc. (Carlsbad, CA, USA). Nella seconda parte della tesi i 192 SNP sono stati utilizzati per determinare la relazione filogenetica tra le due fonti di resistenza alla rizomania Rizor e Holly (Rz1). L’analisi della varianza e delle componenti principali hanno confermato che le fonti Rizor e Holly sono indistinguibili. I risultati molecolari hanno dimostrato che la resistenza usata, dai coltivatori negli ultimi 30 anni, deriva dalle barbabietole maritime collezionate nel delta del Po. Nella terza parte è stato identificato il primo gene di tolleranza ai nematodi (HsBvm-1) in Beta vulgaris spp. maritima e il marcatore molecolare ad esso associato da utilizzare in programmi di miglioramento genetico. La quarta e quinta parte sono state focalizzate sulla resistenza a stress abiotici che compromettono la produzione di zucchero. La tendenza alla prefioritura, dovuta alle basse temperature nelle prime fasi di sviluppo della coltura, è una caratteristica indesiderata che causa gravi perdite nella resa di zucchero e interferisce con la raccolta. Un nuovo locus, implicato nel controllo genetico della tendenza alla fioritura, assieme a un marcatore ad esso legato sono stati mappati sul cromosoma 6. La localizzazione dello SNP sul genoma di riferimento della barbabietola da zucchero ha confermato l’associazione con il carattere della fioritura. Lo SNP è stato mappato in un gene che codifica per una proteina chiamata metalloproteinasi che causa un ritardo della fioritura e una prematura senescenza in Arabidopsis thaliana. Data la positiva e stretta relazione tra la resa in zucchero, il superamento della carenza idrico nutrizionale e le caratteristiche morfo-fisiologiche dell’apparato radicale, un’analisi dei segreganti riuniti è stata condotta per identificare marcatori SNP legati all'accrescimento radicale in barbabietola. Fra i 234 SNP esaminati, lo SNP10139 è risultato associato allo sviluppo radicale. Inoltre, lo SNP è stato mappato in un gene codificante un trasportatore di peptidi che influenza lo sviluppo radicale in Arabidopsis thaliana. In conclusione, gli SNP sviluppati in questo lavoro saranno utilizzati per la genotipizzazione di linee parentali e ibridi di barbabietola da zucchero, con rilevante impatto nei programmi di breeding