Effects of Thaumatin-like proteins, chitinase and plant secondary metabolites on Botrytis cinerea development

In this work the ability of the necrotrophic plant pathogen Botrytis cinerea to counteract two plants antimicrobial proteins – a chitinase and a grape thaumatin-like protein (TLP) from grape– was characterized. These two proteins extracted from grape berries (cv. IM 6.0.13) were added to the B. cinerea culture. The growth of the fungus was not affected by these proteins which, as determined by RP-HPLC, were partially removed from the medium. It was observed that aspartic and serine protease produced by B. cinerea cleave chitinase only, while the B. cinerea mycelium absorbs passively both proteins. In fact, both chitinase and TLP were released from the fungal cell wall when the mycelium was treated with an alkaline buffer and a laminarinase (β-1,3 glucanase) preparation. In particular, a stronger interaction between chitinase, TLP and a β-1,3-1,6-glucan polymer (scleroglucan) was observed. Therefore, B. cinerea can entrap TLP and chitinase in its cell wall, and particularly by the layer of β-glucan that surrounds fungal hyphae. To investigate if TLP and chitinase can induce the synthesis of new fungal cell wall material, the expression of β glucan synthase, chitin synthase and chitin deacetylases was investigated. The expression of the β glucan synthase genes was not affected by both TLP and chitinase while the expression of genes encoding chitin synthase and chitin deacetylases, responsible for the synthesis of chitin and chitosan, respectively, was lowered following the treatment with the grape proteins. Localization experiments of the cell wall components in the mycelium of B. cinerea showed that chitin is mainly present in the vegetative hyphae, chitosan predominate in infection cushions and β-glucan is evenly distributed. A model describing the mechanisms by which B. cinerea could escape the action of plant TLP and chitinase is proposed.In questo lavoro è stata studiata la capacità del fungo necrotrofo Botrytis cinerea di contrastare l’effetto di due proteine antimicrobiche – una chitinasi e una proteina thaumatin-like (TLP) di vite – presenti in elevata quantità negli acini di uva. Queste proteine estratte dall’uva (Vitis vinifera cv. IM 6.0.13) e somministrate alle colture di B. cinerea non hanno alterato la crescita del fungo neppure ad alte concentrazioni delle due proteine. Analisi mediante RP-HPLC hanno dimostrato che TLP e chitinasi vengono rimosse dal mezzo di coltura. Le attività aspartil- e serin-proteasica prodotte da B. cinerea in presenza di proteine dell’uva sono in grado di degradare la chitinasi ma non la TLP. Il micelio di B. cinerea, invece, si è dimostrato capace di adsorbire passivamente ambedue le proteine di vite. Infatti, dopo trattamento con un buffer alcalino e con β-1,3-glucanasi, il micelio rilascia significative quantità di TLP e chitinasi. In particolare una forte interazione è stata osservata tra le due proteine e il β-1,3-1,6-glucano (scleroglucano) di parete del fungo. Queste evidenze suggeriscono un ruolo protettivo dei β-glucani che rivestono le ife del fungo dall’azione delle proteine della pianta. Per verificare se TLP e chitinasi inducono la sintesi di nuovo materiale di parete, è stata studiata l’espressione della β-glucan sintasi, della chitin sintasi e della chitin deacetilasi di B. cinerea in seguito al trattamento con TLP e chitinasi. Queste analisi hanno evidenziato che il livello di espressione della β-glucan sintasi di B. cinerea non è influenzato dal trattamento con TLP e chitinasi mentre l’espressione dei geni codificanti chitin sintasi e chitin deacetilasi – responsabili, rispettivamente, della sintesi di chitina e chitosano – diminuiscono in seguito al trattamento con le proteine dell’uva. Esperimenti di localizzazione nel micelio di B. cinerea dei polimeri di parete hanno evidenziato che la chitina è presente principalmente nelle ife vegetative, il chitosano prevale nei cuscinetti di infezione e i β-glucani sono presenti ubiquitariamente. I risultati ottenuti consentono di proporre un modello che descrive i meccanismi con cui B. cinerea può sfuggire all’azione della TLP e della chitinasi di pianta