CONGENITAL ERYTHROCYTOSIS ARE RARE DISORDERS WITH MANY GENES INVOLVED. FUNCTIONAL EVALUATION OF NOVEL PHD2 AND EPOR MUTATIONS.

Congenital Erythrocytosis (CE) are rare and heterogeneous clinical entities. They are caused by genetic deregulation of the erythroid production resulting in increased production of red blood cells (RBCs). Primary Congenital Familial Polycythemia (PCFP) is due to erythropoietin receptor (EPOR) mutations and is associated with reduced levels of serum erythropoietin (EPOs). Secondary CE are characterized by high EPOs levels, may be due to mutations of the oxygen-sensing pathway (OSP) genes: von Hippel-Lindau (VHL), hypoxia-inducible factor 2 alpha (HIF2A/EPAS1) and prolyl hydroxylase 2 (EGLN1/PHD2). Within 106 patients followed in our centre with sporadic not myeloproliferative erythrocytosis we found 9 mutations (8,5%) in the involved genes. Here we report the functional studies of 1 novel PHD2 (c.1045G>A) and of 2 EPOR gene missense mutations (c.1013G>A and c.1022C>T). To evaluate the HIF transcriptional activity of PHD2 mutation, an in cellulo reporter assay has been performed, while the hydroxylation capacity of PHD2 variants has been tested with an in vitro Hydroxylation test. PHD2 variant does not show a clear loss-of-function of the PHD2 proteins. More sensitive tests could be developed and other PHD2 partners may be tested in this patient. The activation of EPOR mutated signaling was evaluated with a kinetic assay using transfected K562 cell lines. The EPOR signaling cascade results more active in mutated cells than in the WT cells when stimulated with EPO as shown by higher phosphorylation of STAT5 and ERK. Both mutations impair the C-terminal negative regulatory domain and determine gain-of-function in the EPOR signalling cascade. These are the first missense mutations of EPOR with a functional demonstrated activity that affect the EPOR signaling cascade. Other candidate genes need to be investigated to completely understand the ethiology of high hematocrit (HCT) level both in congenital and sporadic erythrocytosisLe Eritrocitosi Congenite (CE) sono entità cliniche rare ed eterogenee. Esse sono causate dalla deregolazione genetica della produzione eritroide con conseguente incremento della produzione delle cellule rosse del sangue (RBCs). La Policitemia Congenita Primaria Familiare (PCFP) è dovuta a mutazioni del recettore dell’eritropoietina (EPOR) ed è associata a bassi livelli di eritropoietina sierica (EPOs). Le CE secondarie, invece, sono caratterizzate da elevati valori di EPOs dovuti ad alterazioni dei geni dell’ Oxygen Sensing Pathway (OSP): von Hippel- Lindau (VHL), hypoxia-inducible factor 2 alpha (HIF2A/EPAS1) e prolyl hydroxylase 2 (EGLN1/PHD2). Nel nostro centro sono stati seguiti 106 pazienti con eritrocitosi sporadica non mieloproliferativa nei quali abbiamo trovato 9 mutazioni (8,5%) nei geni candidati. Al fine di valutare l’attività trascrizionale di HIF in presenza di PHD2 mutato è stato messo a punto un reporter assay in cellulo, mentre l’attività di idrossilazione di PHD2 è stata testata con un hydroxylation test in vitro. Non è stata riscontrata una chiara loss-of-function per la variante di PHD2 nonostante il link mutazione-malattia. Pertanto si necessita lo sviluppo di test più sensibili oltre allo studio di altri geni partner. La cascata del segnale di EPOR mutato è stata studiata effettuando una cinetica di stimolazione su cellule K562 trasfettate. In seguito a stimolazione con EPO il signaling di EPOR è risultato più attivo in condizioni mutate rispetto al wild type rilevando alti livelli di fosforilazione di STAT5 e ERK. Entrambe le mutazioni compromettono il dominio regolatore negativo C-terminale di EPOR causando una gain-of-function del recettore. Queste sono le prime mutazioni missenso in cui in cui è stata rilevata un’iperattivazione dei componenti della cascata del segnale di EPOR. Altri geni candidati devono essere investigati per comprendere completamente l’eziologia degli alti valori di ematocrito (HTC) sia nei casi di eritrocisi sporadiche sia in quelle congenite