Sindrome delle apnee ostruttive del sonno: messa a punto di un modello in vitro per mimare l’ipossia intermittente su cellule di microglia umana

La sindrome delle apnee ostruttive del sonno (OSAS) è una condizione patologica appartenente alla categoria dei disturbi respiratori del sonno che colpisce prevalentemente gli adulti. L’eziopatogenesi dell’OSAS può essere ricondotta a patologie pregresse, quali l’obesità, ma età, sesso maschile, menopausa e disarmonie cranio-facciali rappresentano un fattore di rischio. Questa patologia è causata da un’ostruzione totale (apnea) o parziale (ipopnea) delle vie aeree superiori e comporta oscillazioni della pressione parziale dell’ossigeno (pO2) nel sangue arterioso, ipercapnia e risvegli frequenti nelle persone che ne sono affette. A livello tissutale le oscillazioni della pO2 causano fenomeni di ipossia a Intermittenza (IH), ossia di rapidi cicli di ipossia e riossigenazione che possono causare stress ossidativo ed una sovrapproduzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in alcuni tessuti, con conseguente infiammazione a livello periferico. Evidenze in letteratura sostengono che l’infiammazione periferica può portare ad infiammazione a livello del sistema nervoso centrale e che l’IH rappresenta un fattore di rischio per l’insorgenza di declino cognitivo nei pazienti affetti da OSAS. I meccanismi alla base del legame tra neuroinfiammazione, OSAS e declino cognitivo non sono ben chiari e necessitano di ulteriori studi. Studi su pazienti si limitano a indagare il fenomeno grazie a tecniche di imaging del sistema nervoso centrale o alla somministrazione di test psicometrici; per questo studi su modelli animali sono ancora molto utilizzati. In questo contesto lo sviluppo di un modello in vitro che possa mimare l’IH su cellule può rappresentare un passo in avanti nella comprensione dell’insorgenza delle conseguenze della patologia OSAS. Lo scopo di questa tesi è stato quello di mettere a punto un modello sperimentale in vitro di Ipossia a intermittenza con lo scopo di utilizzarlo per poter studiare questo fenomeno e caratterizzarlo dal punto di vista dei meccanismi molecolari. Il sistema è costituito da quattro componenti collegate tra loro: bombole di gas (O2, N2, CO2), un miscelatore, scatole di resina realizzate mediante stampante 3D dove poter introdurre piastre Petri o multiwell per colture cellulari e un incubatore per colture cellulari. Le cellule sono state seminate su apposite piastre Lumox, che presentano un fondo semipermeabile che permette loro di essere sensibili in tempi brevi ai cambiamenti repentini dei livelli di ossigeno. Per validare il funzionamento del modello in vitro è stata utilizzata una linea cellulare di microglia umana (C20) che è stata sottoposta a due diversi protocolli di Ipossia a Intermittenza, che differiscono per il fatto che sono seguiti o meno da un periodo di riossigenazione. Dopo i trattamenti è stata valutata la vitalità cellulare con conta con colorante Trypan Blue e l’attività metabolica delle cellule con saggio MTS; inoltre per valutare l’effettiva riuscita dei protocolli di Ipossia a Intermittenza sono stati quantificati i livelli della proteina HIF-1 mediante kit ELISA e lo stato ipossico delle cellule mediante l’utilizzo di un kit di detection di ipossia. Il kit è basato sulla quantificazione della fluorescenza emessa da un anticorpo coniugato ad un fluoroforo fluorescente (Alexa Fluor 488®) che è in grado di riconoscere degli addotti formati in caso di ipossia dal composto EF5 con le macromolecole biologiche. I risultati ottenuti hanno confermato che le cellule sottoposte a trattamenti di ipossia a intermittenza rispetto a quelle tenute e in condizioni di normossia mantengono una vitalità inalterata ma mostrano un accumulo maggiore di HIF-1α, un’attività metabolica ridotta e un maggiore stato ipossico. Questo lavoro rappresenta un primo passo verso la validazione di un modello in vitro che mimi la condizione di ipossia intermittente a cui sono sottoposte le cellule di microglia a causa dell’OSAS. Data la difficoltà di ottenere rapidi cambiamenti di ossigeno nelle colture cellulari e avere modelli in vitro validi ed efficaci nel mimare questa condizione il suo utilizzo può essere importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base dei danni provocati dall’IH e dall’OSAS, portando a una maggiore conoscenza dei meccanismi alla base del legame tra neuro-infiammazione e declino cognitivo