Valutazione dell'attivita di composti antivirali e della loro interazione farmacologica nell'inibizione della replicazione del virus ZIKA

Zika (ZIKV) è un virus neurotropico appartenente alla famiglia dei Flaviviridae, presenta un genoma a ssRNA con polarità positiva e sfrutta l’endocitosi come meccanismo d’ingresso all’interno della cellula ospite. Il virus ZIKV è trasmesso principalmente attraverso le punture di zanzare infette, specialmente del genere Aedes. Tuttavia, può essere trasmesso anche in modo diretto per via sessuale o per trasmissione verticale. Nella maggior parte dei casi l’infezione da ZIKV non causa severe conseguenze; tuttavia, è stato descritto che questa infezione durante la gravidanza può essere associata a disturbi nello sviluppo nervoso (microcefalia), mentre negli adulti può causare la sindrome di Guillan-Barrè. Diversi studi in vitro hanno dimostrato l’efficacia della ribavirina, farmaco di elezione nel trattamento di infezioni da virus a RNA, nel bloccare la replicazione di ZIKV. Questo farmaco agisce inibendo l’attività della RNA polimerasi virale, con conseguente blocco della sintesi dei trascritti virali e della replicazione del genoma. Lo scopo principale di questo elaborato di tesi è valutare l’azione di un altro farmaco di recente sviluppo come composto ad attività antivirale in associazione con la ribavirina. Il farmaco in questione, attualmente in fase di sperimentazione per il trattamento del dolore cronico, è un inibitore dell’enzima N-Acylethanolamine-hydrolyzing Acid Amidase (NAAA), responsabile della degradazione della palmitoiletanolamide (PEA), un lipide endogeno con funzioni antinfiammatorie e analgesiche. Risultati preliminari svolti nel nostro laboratorio mostrano che l’ablazione genica di NAAA rende le cellule meno suscettibili all’infezione da ZIKV. Nel presente lavoro verrà valutato il possibile effetto sinergico tra i due composti nel trattamento dell’infezione da ZIKV. Il sinergismo è definito come un effetto complessivo dei due farmaci combinati maggiore della somma dei singoli effetti: questo fenomeno può comportare una riduzione della dose di somministrazione dei due farmaci, e conseguentemente diminuire gli effetti collaterali della ribavirina e degli inibitori di NAAA. A questo scopo, cellule epiteliali alveolari adenocarcinomiche umane (A549) sono state utilizzate come modello di infezione da ZIKV: le cellule sono state infettate col virus e trattate con diverse concentrazioni dei due farmaci al fine di valutare a quali combinazioni di concentrazioni fosse effettivamente possibile vedere un effetto antivirale combinato. Le concentrazioni d’interesse sono state valutate mediante analisi in High-Content Screening. L’analisi si basa su acquisizioni multiple di immagini di microscopia confocale che poi vengono analizzate da un algoritmo in grado di estrapolare diverse informazioni quali: tossicità, localizzazione, intensità e struttura cellulare. L’analisi in High-Content ci ha permesso di analizzare contemporaneamente e a diverse concentrazioni l’azione dei due farmaci su A549 infettate con ZIKV. L'efficacia della combinazione dei farmaci è stata valutata tramite Real-Time qPCR. L'interazione tra i due farmaci è stata studiata mediante il software CompuSyn