Investigation of toxin genes of clostridium difficile strains isolated from hospitalized patients with diarrhoea at Marmara University Hospital

Toksijenik Clostridium difficile kökenleri kendiliğinden iyileşen ishalden, yaşamı tehdit eden kolite kadar değişen antibiyotikle ilişkili hastalıklara yol açmaktadır. Bu enfeksiyonların patogenezinde, bakteri tarafından üretilen toksin A ve toksin B büyük rol oynamaktadır. Ancak son yıllarda, bazı ülkelerde, virülansı yüksek yeni C.difficile kökenlerine (varyant toksin veya binary toksin pozitif) bağlı, antibiyotik ile ilişkili ishal epidemileri tanımlanmıştır. Bu çalışmada, hastanemizde yatan ishalli hastalardan izole edilen C.difficile kökenlerinin toksin gen profillerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Eylül 2006-Mart 2008 tarihleri arasında Marmara Üniversitesi Hastanesinde yatan, ishali olan 633 hastanın dışkı örnekleri dahil edilmiştir. Tüm örneklerde C.difficile toksin varlığı, ticari bir enzim immünoassay (ImmunoCard Toxins A&B EIA; Meridian Diagnostics, Belçika) kiti ile araştırılmıştır. Örneklerin kültürü sikloserin-sefoksitin-fruktoz agar (CCFA; BioMerieux, Fransa) kullanılarak anaerop koşullarda yapılmış; izolatlar, klasik yöntemlerle ve Rapid ID 32A (BioMerieux, Fransa) kiti ile tanımlanmıştır. Dışkı örneklerinden izole edilen C.difficile kökenlerinin toksin üretimi “Triage C.difficile Panel” (Biosite Diagnostics, İtalya) ve “ImmunoCard Toxins A&B EIA” (Meridian Diagnostics, Belçika) ticari kitleri ile; toksin A (tcdA), toksin B (tcdB) ve binary toksin (cdtA ve cdtB) genleri ise “in-house” polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. Çalışmamızda, 26’sı erkek ve yaş ortalaması: 35.9 ± 27.6 yıl (yaş aralığı 2-> 65 yıl) olan 50 (%7.9) hastanın dışkı örneğinden C.difficile üretilmiştir. İzole edilen tüm kökenlerde (n= 50), “Triage C.difficile Panel” kiti ile gluta- mat dehidrogenaz enzimi pozitif bulunmuş, aynı kit ile bunların 28 (%56)’inde toksin A varlığı da saptanmıştır. Doğrudan dışkı örneklerine uygulanan EIA testi ile toksin pozitiflik oranı %4.7 (30/633) olarak saptanmış, buna karşın C.difficile izolatlarından (n= 50) hazırlanan kültür filtratlarında aynı yöntemle toksin pozitifliği %5.7 (36/633) olarak bulunmuştur. Buna göre, EIA kitinin dışkı örneklerinde toksini belirleme açısından duyarlılığının %85.7 olduğu belirlenmiştir. Kültür filtratlarında toksin pozitifliği saptanan 36 kökenin hepsinde PCR ile toksin A ve toksin B genlerinin (tcdA+/tcdB+) varlığı tespit edilmiştir. İzolatlar arasında varyant kökenlere (tcdA-/tcdB+) veya binary toksin genine sahip kökenlere rastlanmamıştır. Çalışmamızda ayrıca, toksijenik C.difficile izole edilen hastaların %77.8 (28/36)’inin beta-laktam grubu (penisilin, sefalosporin ve imipenem) antibiyotik kullanım öyküsü olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, hastanemizde yatan ishalli hastalara ait C.difficile izolatlarının toksin gen profilleri ile ilgili olarak elde edilen bulgularımız, gerek hastanemizin gerekse ülkemizin veri tabanları için bir kaynak oluşturacaktır. Şu an için varyant kökenler veya binary toksin genine sahip kökenlerle ilgili bir risk mevcut olmamakla birlikte, ileride oluşabilecek salgınların kontrolünde bu tip araştırmaların sürdürülmesi ve izolatların özelliklerinin izlenmesinin önemli olduğu kanısına varılmıştır.Toxigenic Clostridium difficile strains cause a spectrum of antibiotic-associated diseases ranging from self-limited diarrhea to severe life-threatening colitis. Pathogenesis primarily involves the action of two important cytotoxins, namely toxin A and toxin B. However, epidemics of C.difficile-associated disease due to the novel, highly virulent strains of C.difficile (binary toxin positive and toxin A variant) have been recognised in hospitals of some countries. The aim of this study was to investigate the toxin gene profiles of C.difficile strains isolated from hospitalized patients with diarrhea. The stool specimens collected from 633 inpatients at Marmara University Hospital, Istanbul, Turkey, between September 2006- March 2008, were included to the study. The presence of C.difficile toxins in the samples has been screened by a commercial enzyme immunoassay kit (ImmunoCard Toxins A&B EIA; Meridian Diagnostics, Belgium). Stool samples were also cultivated on cycloserin-cefoxitin-fructose agar (CCFA; BioMerieux, France) at anaerobic conditions, and the isolates were identified by conventional methods and Rapid ID 32A (BioMerieux, France) system. Toxin production of C.difficile strains isolated from stool cultures have been detected by commercially available “Triage C.difficile Panel” (Biosite Diagnostics, Italy) and “ImmunoCard Toxins A&B EIA” (Meridian Diagnostics, Belgium) kits. In-house polymerase chain reaction (PCR) was performed to investigate the presence of genes for toxin A (tcdA), toxin B (tcdB) and binary toxin (cdtA and cdtB). Stool specimens from 50 (7.9%) patients (age range: 2-> 65 years; mean age: 35.9 ± 27.6 years; 26 were male) yielded C.difficile in culture. All of 50 isolates were found positive for glutamate dehydrogenase enzyme and 28 (56%) were found positive for toxin A with “Triage C.difficile Panel” kit. Toxin positivity rate was detected as 4.7% (30/633) with EIA test performed in stool samples directly, however this rate was 5.7% (36/633) in culture filtrates of the isolates (n= 50), with the same test. Since EIA test yielded false negative results in six samples, the sensitivity of this test was estimated as 85.7% by means of the detection of toxin in direct stool samples. All of the 36 toxin-producing C.difficile isolates were found positive for toxin A and toxin B genes (tcdA+/tcdB+), however there were neither variant strains (tcdA-/tcdB+) nor binary toxin gene positive isolates among tested bacteria. Our results have also indicated that 77.8% (28/36) of patients who harbored toxigenic C.difficile strains have the history of beta-lactam antibiotic (penicillin, cephalosporin and imipenem) use. It was thought that the data of this study would constitute a database on the toxin gene profiles of C.difficile in hospitalized patients with diarrhea both in our hospital and Turkey. The current data have indicated that for the time being there were no risk for isolates producing new toxin variants or binary toxin, however, continuous monitorization of such C.difficile strains is of crucial importance in order to detect the emergence of those strains and establish necessary control and preventive measures