DNA methylation and Cr(VI) stress responses in Scenedesmus acutus: a focus in Sulfur pathway

Algae, as well as plants, are continuously exposed to a variety of abiotic and biotic stresses which could potentially reduce their growth, development, productivity and survival. Therefore, they have developed tolerance, avoidance and resistance mechanisms to cope with these challenging conditions. These mechanisms are very complex and involve the activation of many genes and the interconnection among various signalling pathways regulating numerous metabolic networks. Upon a permanent stress, plants respond with long-term strategies including transgenerational changes involving development of heritable gene expression. In this scenario, it appears evident the relevance of epigenetic mechanisms in assuring plant growth plasticity and withstanding stresses through a rapid and extensive modification of gene expression in a manner that overcomes the restrictions of a highly stable DNA sequence. Epigenome landscape is largely related to DNA methylation process, which is one of the most significant players in the control of plant responses to environmental changes and stressors. Literature data indicate that DNA methylation systems are mosaics of conserved and derived features and that DNA methylation has likely played an important role in plant evolution. In this scenario, algae, represent an important study object, since as plant progenitors, likely evolved ancestral mechanisms of epigenetic regulation. Several algal genomes have been recently sequenced, providing insights into the great complexity of these organisms, nevertheless the complex mechanisms by which DNA methylation modulates stress in algae are yet largely unresolved, mainly with respect to heavy metal stress, for which in plants, metal- and species- specific responses were instead evidenced. For these reasons, in this work, we focused our attention on two strains of the green alga Scenedesmus acutus: the wild type (wt) and a chromium-tolerant strain (Cr-t), the latter selected from the wt population after prolonged culture in Cr(VI) supplemented medium. Since previous studies, conducted by immuno-localization of methylcytosine (5-mC) in CG context, evidenced a different DNA methylation level between the two strains, S. acutus represent a good model to define the reprogramming of epigenetic events leading to the tolerance to external stimuli. In order to gain further insight into relationship between DNA methylation pattern and chromium-tolerance, we performed a comparative whole-genome bisulfite sequencing (WGBS-seq) in Cr-t strain vs wt. The pattern of distribution of 5-mC showed significant differences in Cr-t strain vs wt, concerning both differentially methylated contexts (CG vs CHG, CHH) and differentially methylated regions (DMRs) as well. The results suggest that DNA methylation may be of particular importance in defining signal specificity associated with Cr-tolerance and in establishing new epigenetic marks which can not only contribute to a better adaptation to metal stress, but also transmit the epigenomic traits to the progeny. The analysis showed a differential methylation between strains in different pathways common with those involved in Cr(VI) stress response in other plants, among these genes involved in sulfur metabolism. Given the relationship between chromium stress and sulfur reductive assimilation pathway and even the sulfur requirement in the synthesis of molecules scavengers of heavy metals (e.g. phytochelatins, metallothioneins), we paid a particular attention to some genes for sulfur uptake/assimilation. Our data shows that DNA methylation plays an important role in modulating the differential expression level of the analysed genes in the two S. acutus strains. These results strengthen the hypothesis of a link between the enhanced sulfate uptake/assimilation pathway shown by Cr-t strain and its Cr(VI)-tolerance and suggest that epigenetic mechanisms can have been at the basis of the onset of metal tolerance mechanism.Le alghe e le piante, essendo continuamente esposte a stress biotici e abiotici che possono ridurne crescita, sviluppo, produttività e sopravvivenza, hanno sviluppato complessi meccanismi per far fronte a queste difficili condizioni. Questi meccanismi coinvolgono l’attivazione genica e l’interconnessione tra vari pathways, regolando numerosi network metabolici. Di fronte a stress permanenti, le piante rispondono con strategie a lungo termine, fra cui cambiamenti transgenerazionali basati sullo sviluppo della ereditabilità dell’espressione genica. Appaiono quindi rilevanti i meccanismi epigenetici che attraverso una rapida ed estesa modificazione dell’espressione genica garantiscono alle piante la plasticità di crescita e la resistenza agli stress superando le restrizioni imposte dalla fissità dell’informazione codificata nel DNA. Il “panorama epigenetico” è in gran parte correlato alla metilazione del DNA, uno dei meccanismi maggiormente coinvolti nel modulare la risposta delle piante ai cambiamenti ambientali e agli stress. Dati in letteratura indicano che i sistemi di metilazione del DNA sono mosaici di caratteristiche conservate e derivate, e che la metilazione del DNA ha svolto un ruolo importante nell'evoluzione delle piante. In questo scenario le alghe, rappresentano un importante oggetto di studio, dato che, in quanto progenitrici delle piante, hanno probabilmente sviluppato meccanismi ancestrali di regolazione epigenetica. Recentemente, diversi genomi algali sono stati sequenziati, fornendo una maggiore comprensione della grande complessità di questi organismi. Nonostante ciò, le funzioni di molti geni predetti nelle alghe, e i complessi meccanismi attraverso cui la metilazione del DNA modula la risposta allo stress, sono ancora poco indagati, soprattutto per quanto concerne la risposta ai metalli pesanti, per la quale sono invece note risposte metallo- e specie-specifiche nelle piante. Per queste ragioni abbiamo studiato due ceppi dell’alga verde Scenedesmus acutus: il wild type (wt) e il ceppo cromo-tollerante (Cr-t), selezionato dopo prolungata coltura in terreno contenente cromo esavalente Cr(VI). Dato che studi precedenti di immunolocalizzazione della 5-metilcitosina (5-mC) nei contesti CG mostravano un diverso livello di metilazione di DNA tra i due ceppi, S. acutus rappresenta un buon modello per definire la riprogrammazione di eventi epigenetici che portano alla tolleranza agli stimoli esterni. Per approfondire ulteriormente il rapporto tra il pattern di metilazione del DNA e la tolleranza al Cr, abbiamo eseguito un whole-genome bisulfite sequencing comparando il ceppo Cr-t vs wt. Il pattern di distribuzione della 5-mC ha mostrato differenze significative tra Cr-t e wt, sia nei contesti (CG, CHG e CHH) che nelle regioni differenzialmente metilate (DMR). I risultati suggeriscono quindi che la Cr-tolleranza sia mediata da tratti epigenetici coinvolti nell’adattamento allo stress da metallo e nella trasmissione della Cr-tolleranza alla progenie. Le analisi mostrano una differente metilazione tra i ceppi, in diversi pathways comuni a quelli coinvolti nella risposta allo stress da Cr(VI) in altre piante, tra cui i geni del metabolismo dello zolfo. Data la relazione esistente tra stress da Cr(VI) e via di assimilazione riduttiva del solfato e dato il fabbisogno di zolfo nella sintesi di molecole scavengers di metalli pesanti (es. fitochetilatine e metallotioneine), abbiamo focalizzato l’attenzione su alcuni geni coinvolti nel pathway del solfato. I risultati ottenuti evidenziano un ruolo importante della metilazione del DNA nella modulazione della espressione dei geni analizzati nei due ceppi di S. acutus, rafforzando l'ipotesi di un collegamento tra la via di assorbimento/assimilazione del solfato aumentata nel ceppo Cr-t e la sua tolleranza al Cr(VI) e suggeriscono che meccanismi epigenetici possono essere stati alla base dell'insorgenza del meccanismo di tolleranza dei metalli