Obtenção e caracterização de mutante de Azospirillum brasiliense excretor de amônio e caracterização dos genes ipdC, flcA e narL-like envolvidos na interação com gramíneas

Orientador: Dr. Emanuel Maltempi de SouzaCoorientador: Dr. Eduardo BalsanelliTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 27/04/2018Inclui referências: p. 98-114Resumo: Bactérias do gênero Azospirillum são capazes de colonizar e promover o crescimento de diversas gramíneas de interesse agrícola devido, principalmente, a produção de fitohormônios e a fixação biológica de nitrogênio (FBN). Buscando aumentar a promoção de crescimento vegetal pela FBN, mutantes excretores de amônio têm sido isolados por resistência a etilenodiamina. Utilizando-se dessa ferramenta visa-se isolar mutantes capazes de fixar nitrogênio constitutivamente (fenótipo NifC) e excretar o amônio (produto da fixação) e, dessa forma, aumentar o fornecimento do nitrogênio fixado para a planta associada. Neste trabalho mutantes de Azospirillum resistentes a etilenodiamina foram isolados e selecionados quanto à sua capacidade de fixar nitrogênio e liberar o NH4 + no meio. Um dos mutantes NifC, 38 SF0, foi capaz de excretrar NH4 + e apresentou uma mutação no gene glnA que resultou na substituição do aminoácido Q (glutamina) por R (arginina) na posição 35 da glutamina sintetase. Esta mutação pode ter alterado a estrutura tridimensional da glutamina sintetase, ocasionando a diminuição da atividade da enzima, o que poderia explicar o fenótipo excretor de amônio no mutante. Sob condições de crescimento axênico, o mutante 38 SF0 foi capaz de colonizar as raízes e promover o crescimento de plantas de trigo e milho, quando comparadas com plantas inoculadas com a estirpe selvagem. Diante disto, a utilização da estirpe mutante excretora de amônio 38 SF0 como biofertilizante agrícola, representa uma alternativa promissora para potencializar a indução do crescimento vegetal por A. brasilense. Por ter sido selecionada por mutações espontâneas, está estirpe pode ser utilizada no campo de acordo com as normas do Ministério da Agricultura. Para que Azospirillum promova o crescimento vegetal é necessário que haja uma interação bem-sucedida com a planta hospedeira. No entanto, os fatores envolvidos na interação Azospirillum-planta não são completamente conhecidos. Assim, outro objetivo deste trabalho foi construir estirpes mutantes de Azospirillum brasilense estirpe FP2 nos genes flcA, narl-like e ipdC e caracterizar seu envolvimento na interação com gramíneas. Os fenótipos das estirpes mutantes, DeltaflcA, DeltanarL-like e DeltaipdC, foram avaliados quanto a atividade da nitrogenase, produção de ácido indol acético, floculação, ligação ao vermelho congo, formação de biofilme em fibra de vidro e a capacidade de colonização de raízes de trigo. A capacidade de fixar nitrogênio não foi afetada nos mutantes nocauteados e interessantemente o mutante DeltanarL-like apresentou um nível de atividade nitrogenase in vitro maior que a estirpe selvagem. Os níveis de produção de ácido indol acético no mutante DeltaipdC foi significativamente menor que o da estirpe selvagem. O mutante incapaz de flocular, DeltaflcA, e o mutante DeltanarL-like apresentaram menor capacidade de se ligar ao vermelho congo que a estirpe selvagem, sugerindo uma mudança na composição de polissacarídeos de superfície nestes mutantes. A formação de biofilme nos mutantes DeltaflcA e DeltanarL-like foi 40 % e 50% menor que a da estirpe selvagem, respectivamente. No entanto, o fenótipo de colonização do mutante DeltaflcA não diferiu da estirpe selvagem. Curiosamente, o mutante DeltanarL-like apresentou uma população epifítica maior que a da estirpe selvagem no ensaio de colonização de raízes de trigo, sugerindo que, possivelmente, este mutante seja mais eficiente na colonização de raízes.Abstract: Bacteria of the genus Azospirillum are able to colonize and promote the growth of several grasses of agricultural interest mainly due to the production of phytohormones and and biological nitrogen fixation (BNF). Seeking to increase plant growth promotion by BNF, ammonia excretory mutants have been isolated for resistance to ethylenediamine. Using this tool aims to isolate mutants capable of fix nitrogen constitutively (NifC phenotype) and excreting the ammonia (product of the fixation) and, thus, increase the nitrogen supply fixed in the associated plant. In this work, mutants of Azospirillum resistant to ethylenediamine were isolated and selected for their capacity to fix nitrogen and release NH4 + in the medium. One of the NifC mutants, 38 SF0, was able to excrete NH4 + and presented a mutation in the glnA gene that resulted in the substitution of amino acid Q (glutamine) for R (arginine) at position 35 of glutamine synthetase. This mutation may have altered the three-dimensional structure of glutamine synthetase, causing a decrease in enzyme activity, which could explain the ammonium excretory phenotype in the mutant. Under conditions of axenic growth, the 38 SF0 mutant was able to colonize the roots and promote the growth of wheat and maize plants when compared to the plants inoculated with the wild strain. In view of this, the use of the 38 SF0 ammonium excretory mutant strain as an agricultural biofertilizer represents a promising alternative to potentiate the induction of plant growth by A. brasilense. Because it was selected by spontaneous mutations, this strain can be used in the field according to the norms of the Ministry of Agriculture. So that Azospirillum promote plant growth, it is necessary that there is a successful interaction with a host plant. However, the factors involved in the Azospirillumplant interaction are not completely known. Thus, another objective of this work is to construct mutant strains of Azospirillum brasilense strain FP2 in the flcA, narl-like and ipdC genes and characterize their involvement in the interaction with grasses. The phenotypes of the mutant strains, DeltaflcA, DeltanarL-like and DeltaipdC, were evaluated: nitrogenase activity, indole acetic acid production, flocculation, red congo binding, glass fiber biofilm formation and the ability of colonization of wheat roots. The capacity to fix nitrogen was not affected in mutant knockouts and interestingly the DeltanarL-like mutant showed a higher in vitro nitrogenase activity level than the wild-type strain. The levels of indol acetic acid production in the DeltaipdC mutant was significantly lower than that of the wild-type strain. The mutant unable to flocculate, DeltaflcA, and the DeltanarL-like mutant presented lower capacity to connect with the congo red than the wild strain, suggesting a change in the composition of surface polysaccharides in these mutants.The biofilm formation in DeltaflcA and DeltanarL-like mutants was 40% and 50% lower than that of the wild strain, respectively. However, the colonization phenotype of the DeltaflcA mutant did not differ from the wild strain. Interestingly, the DeltanarL-like mutant presented an epiphytic population larger than that of the wild strain in the wheat root colonization assay, suggesting that possibly this mutant is more efficient in root colonization