Regulação dos genes relacionados ao metabolismo de nitrato em Herbaspirillum seropedicae

Orientador: Profª Drª Leda Satie ChubatsuCoorientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/03/2016Inclui referênciasResumo: H. seropedicae, membro das p-proteobactérias, é um diazotrofo capaz de colonizar tecidos internos de gramíneas de interesse comercial, como trigo, milho e cana-de-açúcar. O processo de fixação de nitrogênio desta bactéria é bem estudado. Entretanto, embora o nitrato seja a principal fonte de nitrogênio inorgânico encontrado nos solos, o metabolismo deste composto em H. seropedicae ainda não é bem conhecido. Análises in silico sugerem que H. seropedicae apresenta genes codificando para duas enzimas que metabolizam nitrato: nitrato redutase assimilatória (NAS) (genes HSERO_RS14545nasA) e nitrato redutase respiratória (NAR) (genes narGHI). Além disso, H. seropedicae apresenta genes codificando os membros dos sistemas de dois componentes, NtrB/NtrC e NtrY/NtrX e mutantes ntrC e ntrY não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio, sugerindo que estes sistemas são importantes para regular genes do metabolismo de nitrato. Face ao exposto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a função das nitrato redutases nAs e NAR de H. seropedicae, e entender a função dos sistemas NtrB/NtrC e NtrY/NtrX na regulação de genes acessórios envolvidos no metabolismo do nitrato. A caracterização fisiológica de um mutante na subunidade catalítica de NAS (mutante nasA) mostra que esta enzima é a principal forma de H. seropedicae assimilar nitrato. Por outro lado, a caracterização de um mutante na subunidade catalítica de NAR (mutante narG) sugere que esta enzima não é requerida para assimilar ou respirar nitrato. Entretanto, nAr está envolvida na produção de altas quantidades de nitrito, como também na produção de óxido nítrico. Finalmente, NAR parece ser importante para interação planta-bactéria possivelmente por produzir óxido nítrico. Os sistemas NtrY/NtrX e NtrB/NtrC são requeridos para ativar a transcrição do operon que dirige a transcrição dos genes que codificam NAS, razão pela qual os mutantes ntrY e ntrC não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio. Caracterizações in vitro da proteína NtrX mostraram que esta proteína é dimérica e que se liga diretamente a região promotora de narXL, que codifica um par de genes regulatórios relacionados ao metabolismo de nitrato. Análises de "footprinting" com DNase I permitiram a delimitação de uma provável região de ligação de NtrX na região promotora de narXL. Análises do transcriptoma global de um mutante ntrC por RNA-seq sugerem que o sistema NtrB/NtrC é o regulador chave de H. seropedicae em resposta a baixas concentrações de nitrogênio fixado, ativando genes cujos produtos estão envolvidos na recuperação de amônio, e reprimindo genes cujos produtos estão envolvidos no metabolismo energético, além de ativar genes do metabolismo de nitrato, incluindo os genes codificam para transportadores de nitrato (genes nasFED), e para NAS (genes HSERO_RS14545nasA). Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae. Metabolismo de nitrato. Nitrato redutase assimilatória. Nitrato redutase respiratória.Abstract: H. seropedicae, a member of the p-proteobacteria, is a diazotroph that colonizes the internal tissues of crops of economic importance, such as wheat, maize and sugar cane. The nitrogen-fixing process of this bacterium is well known. However, although nitrate is the main inorganic nitrogen source found in soils, the metabolism of this compound in H. seropedicae is not well known. In silico analyses suggest that H. seropedicae presents genes coding for two enzymes that metabolize nitrate: the assimilatory nitrate redutase (NAS) (HSERO_RS14545nasA genes) and the respiratory nitrate redutase (NAR) (narGHI genes,). Additionally, H. seropedicae presents genes coding for the members of the two component system, NtrB/NtrC and NtrY/NtrX, and ntrC and ntrY mutants cannot grow on nitrate as the sole nitrogen source, suggesting that these systems are important to regulate genes of nitrate metabolism. Given that, the aim of this study was to evaluate the function of the nitrate reductases NAS and NAR of H. seropedicae, and to understand the function of the NtrB/NtrC and NtrY/NtrX systems in the regulation of accessory genes related to nitrate metabolism. Physiological characterization of a knock-out mutant for the catalytic subunit of NAS (nasA mutant) shows that it is the main enzyme required to assimilate nitrate. On the other hand, the characterization of a mutant for the catalytic subunit of NAR (narG mutant) suggests that this enzyme is not required to assimilate or respire nitrate. However, NAR is involved in the production of high levels of nitrite, and also in the prodution of nitric oxide. Finally, NAR seems to be important for plant- bacteria interaction probably for producing nitric oxide. The NtrY/NtrX and NtrB/NtrC systems are required to activate the operon that drives the trancription of genes coding for NAS and probably this is the reason the ntrY and ntrC mutants cannot grow using nitrate as the only nitrogen source. In vitro characterization of NtrX protein showed that this protein is dimeric and binds directly to narXL promoter, which drives the transcription of genes related to nitrate metabolism. DNase I footprinting narrowed a putative NtrX binding site in the promoter region of narXL. RNA-seq analyses with ntrC mutant suggest that the NtrB/NtrC system is the master regulator of H. seropedicae in response to low levels of fixed nitrogen by activating genes whose products are involved with ammonium scavenging, and repressing genes whose products are involved with energy metabolism. Besides, this system is important to activate genes of nitrate metabolism, including the genes coding for nitrate transportes (nasFED genes), and for NAS (HSERO_RS14545nasA genes). Key words: Herbaspirillum seropedicae. Nitrate metabolism. Assimilatory nitrate reductase. Respiratory nitrate reductase