Lipases de Penicillium aurantiogriseum Dierckx IOC 4212

Orientador: Prof. Dr. José Domingos FontanaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em BioquímicaInclui referências: p. 139-158Resumo: Este trabalho teve por objetivo o isolamento e seleção de microrganismos produtores de lipases, a otimização das condições de produção e a caracterização cinética e de estabilidade da enzima produzida. Os estudos iniciaram-se com o isolamento de uma cepa de Penicillium aurantiogriseum Dierckx IOC 4212, a partir de uma contaminação de óleo de soja. A cepa selvagem apresentou atividade lipolítica tanto em placas de Petri contendo ágar, Rodamina B e óleo de oliva, quanto em fermentação submersa (1,0 U/mL, 24 h). A otimização da fermentação foi realizada pelo estudo da influência da composição do meio de cultivo na produção da enzima. A adição de sais ao meio de cultivo mostrou favorecer a síntese de lipase, obtendo-se atividade específica máxima de 68 U/mg em 24 h de cultivo. O efeito do pH inicial do meio foi estudado tamponando-se o meio em valores de pH entre 6 e 8. Com tampão fosfato pH 7,0 100 mM observou-se maior atividade lipolítica (3 U/mL, 48 h). Foram realizadas fermentações com a adição de peptona de caseína, peptona de carne, extrato de levedura e sulfato de amônio. Os melhores resultados foram obtidos em meio contendo apenas sulfato de amônio e nitrato de potássio como fontes de nitrogênio (13 U/mL, 72 h). Com a adição de óleos vegetais (oliva, milho, soja e girassol) ao meio, verificou-se que o óleo de oliva foi o melhor indutor, na concentração de 0,5 %. As relações C/N de 2,5 e 5 foram as mais favoráveis para a síntese da enzima. A melhor temperatura para a produção da enzima foi 29 °C, dentro da faixa estudada de 26 a 32 °C. A caracterização cinética e os estudos de estabilidade do extrato enzimático bruto produzido pelo fungo P. aurantiogriseum nas condições ótimas de fermentação foram determinados. O extrato enzimático bruto apresentou pH ótimo de 8,0, temperatura ótima para atividade entre 37 e 60 °C, estabilidade entre os pH 6 e 9 e mostrou-se relativamente estável à temperatura observando-se 100 % de atividade a 28 °C, 77 % a 37 °C, 45 % a 45 °C e 32 % a 50 °C, após 30 minutos de incubação.Abstract: The objective of this work was to isolate microorganisms capable of producing lipases, to optimize the conditions for production of the enzyme and to characterize the kinetics and stability of the enzyme produced. The most promising isolate obtained was a wild strain of Penicillium, isolated as a contaminant of soybean oil, characterized as P. aurantiogriseum Dierckx IOC 4212. This strain showed lipolytic activity in Petri dishes containing agar, Rhodamine B and olive oil, as well as in submerged fermentation in Erlenmeyer flasks (1,0 U/mL, 24 h). The fermentation was optimized through a study of the effect of medium composition and environmental conditions on enzyme production. The addition of mineral salts to the medium favored the production of lipase, with a maximum specific activity of 68 U/mg being obtained in 24 h of culture. The effect of initial pH was studied using media buffered at values between pH 6 and pH 8. The highest activity, obtained with phosphate buffer pH 7.0 100 mM, was 3 U/mL, and occurred at 48 h. In fermentations carried out with the addition of casein peptone, meat peptone, yeast extract and ammonium sulfate as nitrogen sources, the highest lipase yield, of 13 U/mL at 72 h, was obtained with the medium containing ammonium sulfate. Vegetable oils were tested as inducers of lipase production at concentrations of 0.5% (w/v). Olive oil was a better inducer than com, soybean or sunflower oil. C/N ratios of 2.5 and 5 were most favorable for the production of lipase. The optimum temperature for production, within the studied range of 26 to 32 °C, was 29 °C. A kinetic characterization and studies of stability were done with a crude extract obtained from a fermentation performed under the optimum conditions identified in the earlier studies. The optimum pH for activity was 8.0, while there was a broad temperature optimum from 37 to 60 °C. The enzyme was relatively stable at a temperature of 28 °C between pH 6 and pH 9. In studies of temperature stability, after 30 minutes of incubation, the enzyme retained 100% of activity at 28 °C, 77 % at 37 °C, 45 % at 45 °C and 32 % at 50 °C