Avaliação dos efeitos de bismuto de síntese física em células-tronco derivadas do tecido adiposo

Orientador: Dra. Alessandra Melo de AguiarCoorientador: Dra. Cintia Delai da Silva HorinouchiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 31/08/2021.Inclui referências p.90-107Área de concentração:Resumo: Nanopartículas de bismuto (BiNPs) são nanomateriais de grande interesse biomédico, sendo investigadas principalmente no desenvolvimento de biossensores, terapias para o tratamento de câncer e no diagnóstico por imagem. Entretanto, pouco se sabe acerca da toxicidade de BiNPs de síntese física em células humanas. Nesse sentido, as células-tronco mesenquimais (CTMs) representam um vantajoso modelo in vitro para avaliação da toxicidade de nanopartículas por suas características específicas, como autorrenovação e potencial de diferenciação. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade de BiNPs produzidas por ablação a laser em meio líquido (LASiS) em células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs). Após a síntese, as BiNPs foram caracterizadas por espectrometria UV/VIS, espalhamento dinâmico da luz (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e potencial zeta. Em seguida, o efeito das BiNPs na viabilidade celular relativa de ADSCs foi determinado pelos ensaios de captação do vermelho neutro (VN), MTT e quantificação nuclear com DAPI. A análise da interação entre BiNPs e ADSCs à nível ultraestrutural foi realizada por MET, ao passo que a proliferação celular foi analisada através de imunomarcação de Ki-67 e incorporação de EdU. A toxicidade mitocondrial de BiNPs foi avaliada através dos parâmetros de massa (MitoTracker® Green FM) e atividade mitocondrial (JC-10). Os efeitos de BiNPs na diferenciação adipogênica e osteogênica foram quantificados após 14 ou 21 dias, respectivamente, através de sistema high content imaging Operetta™ e/ou RT-qPCR. A caracterização físico-química confirmou a presença de BiNPs na solução coloidal, que apresenta pico plasmônico entre 250 - 260 nm, morfologia esférica e tamanho heterogêneo, tendo potencial zeta entre -3,55 ± 1,28 e -8,55 ± 1,23 mV. Os ensaios de citotoxicidade demonstraram que as BiNPs reduziram a viabilidade celular de ADSCs somente na concentração mais alta testada (345 µg/ml), sendo que as três técnicas apresentaram perfil citotóxico semelhante. A análise morfológica realizada por MET confirmou que as BiNPs induziram estresse celular somente em elevadas concentrações (302,24 µg/ml), equivalentes ao IC50 do ensaio de MTT. Além disso, a exposição as BiNPs aumentaram a expressão do marcador de proliferação celular Ki-67 e a incorporação do análogo de timina EdU, indicando que as BiNPs podem induzir a proliferação celular. As BiNPs promoveram hiperestimulação mitocondrial através do aumento do potencial de membrana mitocondrial de ADSCs. A adipogênese foi inibida após exposição única ou repetida à BiNPs, conforme observado através da redução na formação de gotículas de gordura e dos níveis de expressão de mRNA de marcadores específicos da via adipogênica como o PPARgama, CEBPA e FABP4. Assim, as BiNPs exercem toxicidade sobre diferentes parâmetros celulares de ADSCs, incluindo a diferenciação celular, reforçando a importância de uma avaliação toxicológica abrangente dos mecanismos de toxicidade e interação celular para estabelecer a segurança dessas nanopartículas.Abstract: Bismuth nanoparticles (BiNPs) are nanomaterials of great interest for biomedical applications, being mainly investigated in the development of biosensors, cancer therapy and diagnostic imaging. However, little is known about the toxicity of physically-synthesized BiNPs in human cells. Mesenchymal stem cells (MSCs) represent an advantageous in vitro model for toxicity evaluation of nanoparticles due to their specific cell characteristics, such as self-renewal and differentiation potential. Thus, this study aimed to evaluate the toxicity of BiNPs produced by laser ablation solution (LASiS) in human adipose derived stem cells (ADSCs). BiNPs were characterized by UV/VIS spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM) and zeta potential. Afterwards, relative cell viability of ADSCs was assessed by neutral red uptake assay (NRU), MTT and quantification of cell number with DAPI after BiNPs exposure. Interaction between BiNPs and ADSCs at the ultrastructural level was investigated through TEM, while cell proliferation was assessed by Ki-67 immunostaining and EdU incorporation. BiNPs mitochondrial toxicity was evaluated on mitochondrial mass (MitoTracker® Green FM) and activity (JC-10). Effects of BiNPs on adipogenic and osteogenic differentiation were quantified after 14 or 21 days, respectively, using high content imaging system Operetta™ and/or RT-qPCR. The physicochemical characterization confirmed the presence of BiNPs in the colloidal solution, which has a plasmon peak around 250 - 260 nm, spherical morphology and heterogenous size, presenting zeta potential values between -3,55 ± 1,28 e -8,55 ± 1,23 mV. Cytotoxicity assays demonstrated that BiNPs reduced ADSCs cell viability at the highest tested concentration (345 µg/ml) and the three techniques used for cell viability assessment exhibited similar toxicity profile for BiNPs. Morphological analysis performed by TEM confirmed that BiNPs induced cellular stress only at concentrations equivalent to the IC50 from MTT assay. Furthermore, exposure to BiNPs increased the expression of the cell proliferation marker Ki-67 and the incorporation of thymine analogue EdU, indicating that BiNPs might induce cell proliferation. BiNPs also promoted mitochondrial hyperstimulation by increasing ADSCs mitochondrial membrane potential. Adipogenesis was inhibited after single or repeated exposure to BiNPs, as observed by reduction of intracellular lipidic droplets and mRNA expression levels of specific biomarkers of adipogenic differentiation, such as PPARgama, CEBPA e FABP4. Thus, BiNPs may promote toxicity on different cellular mechanisms of ADSCs, including cell differentiation, reinforcing the importance of a comprehensive toxicological evaluation of mechanisms of cell toxicity and cell interaction to guarantee a safety application of these nanoparticles