Produção e avaliação funcional de soro antiloxoscélico de segunda geração utilizando fosfolipases-D recombinantes atenuadas por mutações sítio-dirigidas

Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigasCoorientadora: Prof. Dra. Luiza Helena GremskiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 17/03/2022Inclui referênciasResumo: Os acidentes loxoscélicos são caracterizados principalmente por uma lesão dermonecrótica no local da picada, acompanhado de espalhamento gravitacional e intensa resposta inflamatória. Manifestações sistêmicas podem, menos frequentemente, estar presentes e são representadas por distúrbios renais e hematológicos podendo levar a óbito. As espécies mais comumente envolvidas nesses acidentes no Brasil são L. intermedia, L. gaucho e L. laeta. O único tratamento específico é o soro antiloxoscélico, que possui a capacidade de reduzir os efeitos do envenenamento. O soro é produzido a partir da imunização de equinos com os venenos das três espécies de Loxosceles citadas. Sabe-se que as fosfolipases-D são as responsáveis pela maioria dos efeitos biológicos observados no loxoscelismo. Esta tese apresenta o desenvolvimento de um soro de segunda geração e avalia sua capacidade de neutralizar os efeitos tóxicos do veneno. Para isso, foi proposto o enriquecimento dos venenos brutos das aranhas-marrons utilizados como antígenos em imunizações com toxinas dermonecróticas (fosfolipases-D) recombinantes com mutações pontuais e biologicamente inativas, mas ativas como estimulantes antigênicos, ou a substituição dos venenos por estas toxinas mutadas para a produção do soro. Sendo assim, foram produzidas três isoformas de toxinas dermonecróticas com mutações sítio-dirigidas comprovadamente sem atividade biológica: D32A-E34A de L. gaucho, W230A de L. intermedia e H12A-H47A de L. laeta para imunizações de coelhos em associação ou não com o veneno bruto das três espécies de Loxosceles. Ensaios de ELISA revelaram que as imunizações começaram a estimular o sistema imune dos coelhos de maneira significativa a partir da segunda imunização. Além disso, observaram-se maiores absorbâncias no grupo Proteínas Recombinantes. Também foram realizados Western Blottings e todos os soros produzidos, exceto o Controle Negativo, foram capazes de reconhecer os venenos de L. intermedia, L. gaucho e L. laeta entre as faixas de 25 kDa e 35 kDa. Nos ensaios in vivo, os soros recombinantes (Mix e Proteínas Recombinantes) foram capazes de reconhecer os venenos loxoscélicos e diminuir edema e dermonecrose causados pela ação do veneno de L. intermedia. No teste de incubação, frente a 1 DMN de veneno de L. intermedia observou-se redução de até 63% no diâmetro médio da lesão necrótica e 82% no diâmetro médio do edema, quando soro Proteínas Recombinantes foi utilizado. Na soroneutralização em orelha de coelhos, similar à etapa de controle de qualidade realizado no Soro Antiloxoscélico observou-se redução de até 56% no diâmetro médio da lesão dermonecrótica, quando o Soro Proteínas Recombinantes foi aplicado. Exames hematimétricos realizados tantos nas imunizações quanto no ensaio de soroneutralização em orelha, demonstraram que as proteínas recombinantes mutadas e os soros produzidos são seguros, não gerando danos aos animais. Os resultados apresentados demonstram o potencial de utilização das proteínas recombinantes mutadas na substituição total ou parcial dos venenos loxoscélicos nas imunizações de animais visando a produção de soro, uma vez que sua capacidade de soroneutralização e diminuição dos sinais clínicos equiparou-se ao do Soro Antiveneno Total produzido em coelhos. Tal substituição possui impacto direto no bem-estar animal, havendo uma dependência menor de aranhas mantidas em laboratório para a extração de veneno.Abstract: Loxoscelic accidents are characterized mainly by a dermonecrotic lesion at the bite site with gravitational spread and intense inflammatory response. Systemic manifestations such as hematological and renal disturbances may be present and can lead to death. The most common species involved on accidents in Brazil are L. intermedia, L. gaucho and L. laeta. The Antiloxoscelic Serum is the only specific treatment capable to reduce the effects of the envenoming. Horses are immunized with venoms from the three cited spiders in order to produce the serum. It is known that phospholipase-D are responsible for the majority of the biological effects seen on loxoscelism. This thesis presents the development of a second-generation serum and evaluates its neutralizing capability against the venom’s toxic effects. The enrichment of brown spider’s venoms used as antigens on immunizations with recombinant dermonecrotic toxins (phospholipase-D) containing site-directed mutations that result on biological inactivity was proposed. Total substitution of the venoms for the mutated toxins was also assessed on the serum’s production. Three dermonecrotic toxins isoforms with site-directed mutations and no biological activities were obtained: D32-AE34A from L. gaucho, W230A from L. intermedia and H12A-H47A from L. laeta. These toxins were used on rabbits’ immunizations in association with Loxosceles venoms or without the venoms. ELISA assays revealed that antibodies concentration started to rise after the second immunization. Besides that, higher absorbances were seen on the Recombinant Proteins groups. Western Blotting tests also showed that all the sera produced were capable to recognize venoms from L. intermedia, L. gaucho and L. laeta between 25 kDa e 35 kDa. Recombinant sera (groups Mix and Recombinant Proteins) were effective decreasing edema and dermonecrosis on rabbits when tested against L. intermedia venom. Incubation assays against 1 NMD from L. intermedia venom showed that Recombinant Proteins serum reduced up to 63% on the medium diameter of the lesions and up to 82% on the medium diameter of the edema. Reduction on the medium diameter of the dermonecrotic lesion (up to 56% when Recombinant Proteins serum was used) was observed when the neutralization was tested on rabbits’ ears, which is the gold standard for the quality control step on the Antiloxoscelic Serum production. Blood tests were run on the immunizations and on the neutralization assay on rabbits’ ears. They demonstrated that the mutated recombinant proteins and sera are safe and didn’t cause any damage to the animals. The results presented reveal the potential for the utilization of the mutated recombinant proteins on the total or partial substitution of the loxoscelic venoms, since the serum obtained has a similar capability of neutralization to the Antiloxoscelic Serum produced in rabbits. There were no significant differences on the comparison between the sera produced. This substitution would be significant to animal welfare, once the need of maintaining spider to extract their venom would be much smaller