Produção e purificação parcial de beta-galactosidade a partir de bactéria isolada do soro do queijo

Orientadora: Profª. Dra Raquel StröherCoorientador: Prof. Dr. Luis Fernando Souza GomesDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Defesa : Palotina, 07/12/2021Inclui referências: p. 74-80Resumo: O soro de queijo é um subproduto das indústrias de laticínios e em sua composição há grande parte da lactose contida no leite. Uma das alternativas de aproveitamento do soro que vem sendo estudada é sua utilização como substrato para produção de enzimas, pois apresenta benefícios econômicos e ambientais. A enzima responsável por hidrolisar a lactose é a ß-galactosidase, também conhecida como lactase. A fonte para produção da lactase pode ser de origem animal, microbiana ou vegetal, sendo que aquela extraída de fontes bacterianas tem apresentado diversas vantagens, como alta atividade, facilidade de fermentação e estabilidade. As bactérias que produzem lactase podem ser encontradas no soro de queijo, devido à quantidade de lactose presente. O objetivo do presente trabalho foi isolar uma bactéria produtora de lactase do soro de queijo, analisar a produção dessa enzima e testar diferentes métodos de extração enzimática. Para isso, a seleção dos microrganismos foi realizada utilizandose a técnica de diluição em série de amostras do soro de queijo em água destilada e o microrganismo foi repicado em placas de Petri contendo meio MRS (Man Rogosa & Sharpe,seletivo para Lactobacillus). Para avaliação da produção de enzima, foi realizado um planejamento experimental do tipo fatorial completo 2² com quadruplicata no ponto central, tendo como variáveis a temperatura (30, 37 e 43 ºC) e a concentração de lactose adicionada ao meio (0, 35 e 70 g L-1); os frascos ficaram sob agitação a 150 rpm e as amostras eram retiradas para análise após 24, 48 e 72 h. Com o objetivo de extrair a enzima, quatro métodos de rompimento celular foram testados: agitação com pérolas de vidro, agitação com areia de quartzo, sonicação e congelamento seguido de sonicação. A atividade enzimática foi quantificada através do método ONPG (orto-nitrofenil-ß-galactosídeo). A variável que apresentou maior efeito significativo foi a temperatura, cujos valores mais elevados alcançaram melhores resultados. A extração através do método de agitação com pérolas de vidro, de forma geral, foi o que apresentou os melhores resultados e o ensaio que apresentou maior atividade enzimática (1,97 U mL-1) foi utilizando-se 0 g L-1 de lactose, a 43 ºC, após 24 h de reação. Dessa forma, foi possível realizar o isolamento de microrganismo produtor da enzima lactase do soro de queijo e avaliar diferentes métodos de rompimento celular para a extração enzimática.Abstract: Cheese whey is a byproduct of dairy industries and its composition includes most of the lactose contained in milk. One alternative for whey utilization that has been widely studied is its use as a substrate for enzyme production, since it presents economic and environmental benefits. The enzyme that hydrolyzes lactose is ß-galactosidase, also known as lactase. The source for lactase production can be from animal, microbial, or plant. ß- galactosidase extracted from bacterial sources has shown a variety of advantages, like high activity, ease of fermentation, and stability. Lactase producing bacteria can be found in cheese whey, due to the amount of lactose present. The aim of the present work was to isolate a lactase-producing bacteria from cheese whey, analyze the production of this enzyme and test different enzymatic extraction methods. In order to do this, the selection of microorganisms was performed using the technique of serial dilution of cheese whey samples in distilled water and the microorganism was plated on petri dishes containing MRS medium (Man Rogosa & Sharpe, selective for Lactobacillus). To evaluate the enzyme production, a 2² full factorial design was conducted, with quadruplicate in the central point, using as variables temperature (30, 37 and 43 ºC) and the concentration of lactose added to the medium (0, 35 and 70 g L-1); the flasks were shaken at 150 rpm and the samples were removed for analysis after 24, 48 and 72 h. In order to extract the enzyme, four methods of cell disruption were evaluated: agitation with glass beads, agitation with quartz sand, sonication, and freezing followed by sonication. Enzyme activity was quantified using the ONPG method (ortho-Nitrophenyl-ß-galactoside). The variable that showed the most significant effect was temperature, whose higher values achieved better results. The extraction through the agitation with glass beads method, in general, was the one that showed the best results and the assay that showed the highest enzymatic activity (1,97 U mL-1) was the one with 0 g L-1 of lactose, at 43 ºC, after 24 h of reaction. Therefore, it was possible to isolate a lactase producing microorganism from cheese whey and evaluate different method of cell disruption for enzyme extraction