Pathogenese des mutierten Ca2+-Kanals CACNA1H beim primären Hyperaldosteronismus und Rolle der zellulären pH-Homöostase für die Regulation der Aldosteronproduktion in Nebennierenzellen

Primärer Hyperaldosteronismus (PA) ist eine der häufigsten Grunderkrankungen, die zur Entstehung von Bluthochdruck führt. Kennzeichnend dabei ist die unkontrollierte Überproduktion des Mineralocorticoids Aldosteron in Zellen der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde. Aldos¬teron aktiviert die Na+ Resorption und K+ Sekretion in der Niere und trägt somit entscheidend zur Regula-tion des Elektrolyt- und Wasserhaushalts bei. Physiologisch erfolgt die Stimulation der Aldosteronproduktion hauptsächlich durch eine erhöhte Plasmakaliumkonzentration und Angiotensin II (Ang II). Beides führt zu einer Depolarisation des Membranpotentials und infolgedessen zum Öffnen spannungs¬aktivierter Calciumkanäle. Dadurch kommt es zum Anstieg der intrazelluläre Ca2+ Konzentration, wodurch Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinasen (CaMK) aktiviert werden und es so letztendlich zu einer erhöhten Expression der Aldosteronsynthase (CYP11B2) kommt. Eine wichtige Rolle spielt hierbei der T Typ Calciumkanal CACNA1H (CaV3.2). Verschiedene Mutationen dieses Kanals konnten in den vergangenen Jahren auch bei PA Patienten gefunden wer-den. Neben Ca2+ spielen aber auch weitere Faktoren eine wichtige Rolle bei der Aldosteron¬synthese. Der intra¬zellulären pH Wert ist einer davon. Über welche Signalwege der pH Wert Einfluss auf die Aldos¬teronproduktion nimmt, ist bisher allerdings unklar. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu untersuchen, welche Auswirkung die CACNA1H-Mutation M1549V auf die Kanalfunktion im adrenalen Zellmodell hat. Dies soll zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie dieser Mutation bei der Entstehung von PA führen. Ein weiteres Ziel war, mögliche Signalwege zu entschlüsseln, über welche der intrazelluläre pH die Aldosteronsynthese reguliert. Mittels Ganzzell Patch Clamp Messungen wurde gezeigt, dass in adrenalen NCI H295R-Zellen CACNA1HM1549V bei physiologischen Ionenkonzentrationen bereits bei stärker hyperpolarisiertem Membranpotential öffnet und somit im Bereich des Ruhemembranpotentials von nativen Glome-rulosazellen aktiv ist. Daneben entwickelten Zellen, welche die Mutante überexprimierten, deutliche Oszillationen des Membranpotentials. Weiterhin wurde gezeigt, dass die veränderten elektrophysio-logischen Eigenschaften von CACNA1HM1549V zu einer Störung der zellulären Ca2+ Homöostase füh-ren. Zusätzlich wurde die Bedeutung der extrazellulären Na+ Konzentration untersucht, da T Typ Calciumkanäle zu einem gewissen Grad auch Na+ permeabel sind. Die Ent¬fernung von Na+ aus der extrazellulären Lösung führte in Zellen mit mutiertem Kanal zu einer Reduktion des CACNA1H-Stroms, der Membranpotentialoszillationen und der intrazellulären Ca2+ Aktivität. Weiterhin wurde gezeigt, dass CACNA1HM1549V zu einer intra¬zellulären Ansäuerung führt, diese Veränderung des pH allerdings nicht ursächlich für die veränderte Ca2+ Aktivität unter Na+ freien Bedingungen ist. Die Versuche verdeutlichen somit die Bedeutung von CACNA1H für die Aldosteronsynthese. Gleichzeitig wird klar, wie CACNA1HM1549V zu einer stimulationsunabhängigen Aldos¬teronproduktion – und somit zum Krankheitsbild des PA – führen kann. Um zu untersuchen, über welche Signalwege der intrazelluläre pH-Wert die Aldosteronproduktion beeinflusst, wurden Zellen mit Kalium oder Ang II und zusätzlich Natriumacetat (NaAc) stimuliert. Gleichzeitig wurden verschiedene Signalwege durch entsprechende Inhibitoren gehemmt. Zunächst zeigte sich, dass NaAc die Kalium- und Ang II-stimulierte Aldosteronproduktion verstärkt. Durch Hemmung von spannungsgesteuerten Calciumkanälen und CaMK wurde deutlich, dass dieser NaAc-Effekt teilweise Ca2+ vermittelt ist. Insbesondere bei Ang II Stimulation werden jedoch weitere pH abhängige Signalwege aktiviert. Eine Hemmung der Proteinkinase C (PKC) und der Proteinkina-se D (PKD) zeigte, dass vor allem die PKD in Ang II-stimulierten NCI Zellen für die Aldos¬teronsynthese wichtig ist und dieser Signalweg auch durch den pH Wert beeinflusst wird. Allerdings scheint die PKD die Aldosteronsynthese vornehmlich über StAR und CYP21A2 zu regulieren, während CYP11B2 dabei eine eher untergeordnete Rolle einnimmt. Des Weiteren wurde eine Proteom¬analyse durchgeführt, wobei unstimulierte und verschieden stimulierte Zellen miteinander verglichen wurden. Hiermit soll-ten weitere Proteine identifiziert werden, die bisher im Zusammenhang mit Aldos¬teron und dessen Regulation unbekannt waren und deren Expression auch durch NaAc beeinflusst wird. Die erhaltenen Kandidaten sollten jedoch in unabhängigen Experimenten nochmals bestätigt werden. Dazu wurden erste Vorversuche durchgeführt, die die Ergebnisse der Proteomanalyse nur teilweise bestätigen. Jedoch sind weitere Versuche nötig, um zu klären, über welche genauen Mechanismen der pH Wert die Aldosteronsynthese beeinflusst