In-situ und in-vitro Untersuchungen zum Einfluss des Endothels auf subendotheliale Matrixschichten

Fragestellung: Die Hauptfunktion der Mikrozirkulation besteht darin, die Organe des Körpers, je nach Anforderungsprofil abgestimmt mit Sauerstoff und Substraten zu versorgen. Die Gefäße der Mikrozirkulation sind aus einer Gefäßintima (Endothel und Basalmembran) und außen liegenden Gefäßmuskelzellen aufgebaut. Zwischen ihnen liegt eine Internal Elastic Lamina (IEL), welcher bezüglich der Genese verschiedener pathologischer Gefäßveränderungen eine wichtige Rolle zugeschrieben wird. Über den Aufbau, die Funktion und den dynamischen Umbau der IEL ist allerdings noch wenig bekannt. Eine wichtige Komponente könnten hierbei aus Endothelzellen über Podosomen («füßchenartige» Zellausstülpungen) freigesetzte Proteasen sein, welche die Basalmembran und IEL-Matrix abbauen könnten. In der vorliegenden Doktorarbeit wird zum einen die Morphologie der IEL in kleinen arteriellen Gefäßen beschrieben und zum anderen Bedingungen für ihren dynamischen Umbau untersucht. Dabei wurde die Hypothese überprüft, ob aus Podosomen des Endothels freigesetzte Proteasen die IEL-Struktur, insbesondere die Fenestrierung der IEL, verändern können und welche physikochemischen Stimuli dabei eine Rolle spielen. Hierhingehend wurde auch ein knock-out Modell der AMPK untersucht, ein metabolisches Schlüsselenzym, bei welchem eine Rolle am Umsatz des Zytoskelettes, der Endothelzellmigration, der Integrität der IEL und weitergehend auch im Rahmen der Tumorentstehung beschrieben ist. Methoden: Zur Beantwortung oben genannter Fragestellung wurden zwei Modelle genutzt: Zunächst wurden in Zellkultur an HUVECs unter verschiedenen physikochemischen Kulturbehandlungen (chemisch: Kontrollbedingungen, bekannte Podosom-Induktoren (PMA, VEGF, TGF-beta) und jeweilige Inhibitoren; physikalisch: verschiedene Shear-Stress-Raten; sowie Kombination aus diesen Behandlungen) und Färbetechniken das Auftreten und die Dynamik von Podosomen untersucht. In einem zweiten Schritt wurde dann der Zusammenhang zwischen Anzahl der Podosomen und der damit zusammenhängenden proteolytischen Aktivität analysiert. Hierzu wurde der Matrixabbau (anhand von Imprints (Abdrücken)) unter den jeweiligen Stimulationsbedingungen in Oregon Green 488 Gelatine mikroskopisch untersucht und quantifiziert. Zum anderen wurden intakte Mesenterial- und Muskelgefäße, die aus der Maus isoliert wurden, untersucht. Zur morphologischen Charakterisierung der IEL wurden zunächst verschiedene Färbetechniken miteinander verglichen (Eosin, Alexa633) und hiernach die IEL und ihre Fenestrierung an Gefäßen unterschiedlicher Größe quantifiziert. Der Nachweis von Podosomen an oben genannten Gefäßen geschah nach Fixierung und Immunfärbung (MMP14 und Cortactin Co-Färbung). Auch wurden hier verschiedene physikochemischen Stimuli (VEGF, unterschiedliche Flussbedingungen durch Ligation an Femoralgefäßen in-vivo und anschliessende Färbung in-vitro) genutzt, um das Auftreten von Podosomen zu analysieren. Durch Kombination der oben genannten Färbetechniken wurde zudem untersucht, inwiefern das Auftreten von Podosomen mit einer veränderten Durchlässigkeit und/oder Fenestrierung der IEL zusammenhängt. Dies wurde sowohl an BL6-Mäusen, als auch an Mesenterialgefäßen von AMPK knock-out Mäusen durchgeführt. Ergebnisse: Das Auftreten von Podosomen (Podosomenrosetten) konnte in HUVECs unter statischen Kontrollbedingungen durch F-Actin und Cortactin Co-Exprimierung nachgewiesen werden. Das Auftreten von Podosomenrosetten wurde hier indirekt über den proteolytischen Abbau und Quantifizierung von dadurch ausgelösten „Imprints“ in fluorszeirender Matrix nachgewiesen. Durch PMA, einen PKC-Aktivator, konnte erhöhtes und durch Inhibitoren des VEGF-Signalkaskade ein erniedrigtes Auftreten von Podosomenrosetten gezeigt werden (basale Anzahl der Podosomrosettenabdrücke /Imprints je mm2: 158 ± 20, PMA: 341 ± 47, GÖ 6983: 160 ± 13, GÖ6983 + PMA: 203 ± 12). Shear-Stress erniedrigte das Auftreten von Imprints in der Gelatinematrix (196 ± 49 vs. niedrig 78 ± 8, mittel 43 ± 9, and hoch 41 ± 4 Podosomrosettenabdrücke/mm²). Dies ging mit einer erniedrigten VEGF-RNA-Expression einher, welche eine gleichzeitig erhöhte VEGF-Rezeptorexpression nicht kompensieren konnte (niedrig 72 ± 12, hoch 59 ± 8 % der RNA-Expression von VEGF unter statischen Bedingungen; niedrig: 193 ± 46 und 300 ±58% der RNA-Expression von VEGFR2 unter statischen Bedingungen). Während zusätzliche VEGF-Applikation unter statischen Bedingungen keinen Einfluss auf das Auftreten von Podosomenrosetten und daraus resultierenden Imprints in der Gelatinematrix hatte, führte eine Applikation unter hohem Shear-Stress zu einer Erhöhung von Imprints (Kontrolle: 39 ± 10, VEGF 92 ± 19). Eine Erhöhung der Podosomenanzahl und proteolytischen Aktivität ging mit einem vermehrten Migrationsverhalten einher. Die IEL konnte in Mesenterialgefäßen am deutlichsten mit einer Alexa633- Färbung nachgewiesen werden. Aufgrund der besseren Quantifizierbarkeit von Lochstrukturen in der IEL wurden primär grosse Muskelgefäße (Arteria femoralis, >300um) und Mesenterialgefäße mit einem Durchmesser ~150μm herangezogen. Neben Unterschieden der Lochstruktur zwischen verschiedenen Gefäßbetten (Muskel vs. Mesenterium) konnte dann gezeigt werden, dass die Lochanzahl zu kleineren Gefäßdurchmessern in Mesenterialgefäßen zunahm, während die mittlere Lochgrösse abnahm und die Gesamtlochfläche unverändert blieb. In Mesenterialgefäßen konnten dann endotheliale Podosomen mit Co-Färbung aus MMP14 und Cortactin nachgewiesen werden. In einem Ligationsmodell der Arteria femoralis über 7 Tage, zeigte sich unter statischen Bedingungen ein gehäuftes Auftreten von Podosomenrosetten (sham 9.2 ± 4.3, ligiert 23.4 ± 6.5 Podosomen pro mm²), welche allerdings nicht mit einer mikroskopisch nachweisbaren morphologischen Veränderung der IEL einherging (konstante Lochzahl und Lochdurchmesser in ligierten und sham-operierten Gefäßen). In frisch isolierten, intakten Mesenterialgefäßen löste eine nachfolgende VEGF-Stimulation ähnliche Effekte aus, Eine Elastase-Behandlung von kultivierten Gefäßen führte zu keiner morphologisch erfassbaren Strukturveränderung der IEL, erhöhte aber Durchlässigkeit der IEL für intraluminal gegebene große Moleküle (Antikörper). Einzig eine Deendothelialisierung der Gefäße konnte die Lochanzahl in 24-Stunden kultivierten Gefäßen erhöhen, was durch Hinzugabe von Proteaseinhibitoren unterbunden werden konnte. An Gefäßen von AMPK-knock-out Mäusen zeigte sich eine erhöhte Lochanzahl in AMPK1 KO-Mäusen im Vergleich zu Gefäßen aus BL-6-Kontrolltieren. Dies ging überraschenderweise sogar mit einem reduzierten Auftreten von Podosomenrosetten einher (3.3 ± 1.8 AMPKα1-KO vs. 12 ± 4.9 CLB57/BL6 Kontrolle), was eine Rolle von Podosomen für dynamische Veränderungen der IEL Struktur unwahrscheinlich macht. Fazit: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine wichtige Rolle von kontinuierlichen physiologischen Shear-Stress bei der Kontrolle der Podosomendynamik in Endothelzellen auf: statische Bedingungen führen VEGF-moduliert zu einer erhöhten proteolytischen Aktivität von kultivierten Endothelzellen. Dieser Befund lässt sich auch in intakten Gefäßen ex-vivo bestätigen, führt allerdings im untersuchten Zeitraum (bis zu 7 Tagen) nicht zu konfokalmikroskopisch auflösbaren Veränderungen an der IEL. Allerdings führt eine vermehrte Anzahl von Podosomenrosetten funktionell zu einer erhöhten Permeabilität der IEL. Zum anderen geht ein Gefäßmodell (AMPKα1 KO), in welchem die Lochanzahl und Gesamtlochfläche in der IEL erhöht ist, nicht mit einer erhöhten Podosomenrosettenanzahl einher. Diese Befunde unterstreichen die wichtige Rolle von Shear-Stress in der Stabilisierung des Endothels vor Umbauvorgängen, während es unter akuter Reduktion des Shear-Stresses (Stase) zur proteolytischen Aktivierung (Remodelingvorgängen) kommen kann, welche in der vorliegenden Arbeit im kofokalmikroskopischen Bereich jedoch nicht zu nachweisbaren Strukturveränderungen der IEL, wohl aber zu einer Permeabilitätssteigerung führte. In diesem Sinne zeigt die vorliegende Arbeit, dass die endotheliale Podosomenregulation durch physikochemische Stimuli ein interessantes Ziel für therapeutische Modulationen von endothelialen Remodelingvorgängen sein kann