Estudios de patogénesis placentaria por Brucella y caracterización molecular de Brucella suis bv2

La tutora de esta tesis es Inmaculada Farrán BlanchLa brucelosis es una zoonosis mundialmente extendida con importantes repercusiones económicas y sanitarias tanto para la ganadería como para el ser humano. Existen doce especies distintas de Brucella con distinta preferencia de hospedador; entre ellas, B. melitensis (bovino), B. abortus (pequeños rumiantes) y B. suis (porcino) son las más frecuentes en el ganado doméstico, y a excepción de B. suis bv2, suponen un grave riesgo para el ser humano. La vacunación de los animales es una herramienta esencial para reducir la infección en los mismos y, así, evitar la transmisión al ser humano. La infección en pequeños rumiantes es ocasionada por las especies Brucella melitensis y B. ovis; la primera de ellas produce abortos a final de gestación en hembras gestantes y la segunda, orquitis y epididimitis en machos con la consecuente reducción de la fertilidad. La cepa atenuada B. melitensisRev1 es la única vacuna recomendada desde hace más de 60 años contra la brucelosis en pequeños rumiantes. Pese a su extendido empleo y demostrada eficacia, Rev1 posee ciertos inconvenientes que recomiendan la búsqueda de una vacuna alternativa más segura que, idealmente, pueda aplicarse en animales gestantes. En este contexto, en el grupo de Brucelosis del IdAB-CSIC, se han desarrollado dos candidatos de Brucella melitensis mediante deleción en fase del gen wzm (16MΔwzmy Rev1Δwzm) involucrado en el sistema de dos componentes Wzm/Wztr es responsable de la exportación del polisacárido O al periplasma bacteriano para completar la biosíntesis del LPS liso. En los Capítulos 1 y 2 de esta Tesis Doctoral, se ha estudiado la seguridad, respuesta inmune y patogénesis placentaria de ambos candidatos vacunales, tanto en modelos preclínicos (i.e. cultivos de células trofoblásticas y ratona gestante) como en ganado ovino de distintos sexos y en distintos tercios de la gestación. Además, se han realizado estudios novedosos de patogénesis placentaria y respuesta inmune a lo largo de la gestación en ratonas inoculadas con distintas cepas de referencia de Brucella como son B. melitensis16M (virulenta) y Rev1 (atenuada) y B. ovis PA. Los principales resultados del Capítulo 1 indicaron que, en comparación con sus parentales, ambos mutantes rugosos poseían menor capacidad de invasión, replicación y efecto citotóxico en trofoblastos BeWo, menor capacidad de colonización placentaria en ratones con resolución de la infección a este nivel en los últimos estadíos de la gestación, ausencia de lesiones placentarias y elevada viabilidad fetal, así como menor respuesta proinflamatoria a lo largo de la gestación murina. En el Capítulo 2, ambos mutantes mostraron atenuación y buena respuesta serológica en carneros, ovejas no gestantes y ovejas gestantes inoculadas por las vías subcutánea o conjuntival, en distintos tercios de gestación. Aunque ninguno de los candidatos indujo abortos, Rev1∆wzmse consideró más seguro que 16M∆wzmpara ovejas gestantes, puesto que este último mostró una reactivación de la infección en el momento del parto, que conllevó la excreción transitoria por placenta/fluido vaginal y/o leche en algunos animales. En conjunto, los Capítulos 1 y 2 nos han permitido establecer una relación entre la multiplicación de Brucella en trofoblastos BeWo y placentas murinas, y su capacidad para inducir abortos y transmitirse a la descendencia en ovejas inoculadas a mitad de gestación. Asimismo, pese a la gran utilidad del modelo de ratona gestante para seleccionar candidatos más seguros, la evaluación final de ciertos parámetros de seguridad debe realizarse en el hospedador natural. Futuros ensayos de eficacia y respuesta inmune en ovino permitirán determinar la utilidad real de Rev1∆wzm, como alternativa a la actual vacuna Rev1.Trascomprobar las buenas propiedades vacunales de Rev1∆wzm, en el Capítulo 3 de esta Tesis se propuso construir un mutante en B. suis bv2 para abordar la lucha contra la brucelosis porcina, mediante la construcción y caracterización de Bs2Δwzm. Este mutante mostró propiedades bioquímicas distintas a 16M∆wzmo Rev1∆wzm, así como menor atenuación de la esperada. Durante estos estudios, detectamos que la cepa parental Bs2 presentaba una marcada inestabilidad de fase L→R no reportada anteriormente. Además, aplicando el modelo de ratona gestante puesto a punto en el Capítulo 1, estudiamos la patogénesis placentaria y respuesta inmune de Bs2 a lo largo de la gestación en ratonas. Por lo tanto, este Capítulo 3 se completó con un detallado análisis genético y fenotípico de la cepa Bs2, con el objetivo de determinar el alcance de dicha inestabilidad de fase tanto in vitro como in vivo, y las bases moleculares responsables de la misma. Los principales resultados indicaron que, en ausencia de escisiones o mutaciones en las regiones genéticas wboy wbk portadoras de genes implicados en la biosíntesis del LPS, este fenómeno podría deberse a variaciones en la expresión bacteriana, en función de las condiciones ambientales. De hecho, los cultivos con un elevado grado de disociación bacteriana mostraron una reducción significativa de la expresión de los genes codificantes de distintas manosil-y glicosil-transferasas, junto con un aumento de la expresión de la proteína de membrana externa Omp2b. Debido a su complejidad, en esta Tesis no ha sido posible determinar con exactitud los mecanismos moleculares implicados en la disociación espontánea de B. suisbv2, por lo que son necesarios más estudios que permitan comprender estos mecanismos, su implicación biológica, y con ello, construir una cepa B. suisbv2 estable sobre la que poder obtener candidatos vacunales adecuados frente a la brucelosis porcina. Uno de los resultados más interesantes de esta Tesis Doctoral ha sido evidenciar, por primera vez, que la disociación de Bs2 observada in vitro tiene una implicación in vivo, encontrando en un mismo animal bacterias con fenotipos lisos en tejidos placentarios y rugosos en tejidos esplénicos de ratones. Futuros estudios en cerdas gestantes permitirán dilucidar si este fenómeno de adaptación bacteriana ocurre también en el hospedador natural.Brucellosis is a worldwide zoonosis with important economic and health implications for both livestock and humans. There are twelve different Brucella species with different host preference; among them, B. melitensis(ovine), B. abortus(bovine) and B. suis(porcine) are the most frequent in domestic livestock,supposinga serious risk to humans. Vaccination of animals is an essential tool to reduce infection and thus, toprevent transmission to humans. Infection in small ruminants is caused by Brucella melitensisand B. ovisspecies; the former causes abortions at the end of gestation in pregnant females and the latter, orchitis and epididymitis in males with the consequent reduction of fertility. The attenuated strain B. melitensisRev1 is the only vaccine recommended for more than 60 years tocontrol of brucellosis in small ruminants. Despite its widespread use and proven efficacy, Rev1 has certain drawbacks that recommend the search for a safer alternative vaccine that, ideally, can be applied in pregnant animals. In this context, in the Brucellosis group of the IdAB-CSIC, two Brucella melitensiscandidates have been developed by phase-deletion of the wzmgene (16MΔwzmand Rev1Δwzm) involved in the two-component Wzm/Wzt system responsible for the export of the O polysaccharide to the bacterial periplasm forbiosynthesis of the smooth LPS. In Chapters 1 and 2 of this PhD Thesis, the safety, immune response and placental pathogenesis of both vaccine candidates have been studied in both preclinical models (i.e. trophoblast cell cultures and pregnant mouse) and sheep of different sex and periodof pregnancy. In addition, novel studies of placental pathogenesis and immune response throughout gestation have been performed in mice inoculated with different Brucellareference strains such as B. melitensis16M (virulent) and Rev1 (attenuated) and B. ovisPA. The main results of the first Chapter indicated that, compared to their parentals, both rough mutants had lower invasiveness, replication and cytotoxic effect on BeWo trophoblasts, lower placental colonization ability in mice with resolution of infection at late pregnancy, absence of placental injuriesand high fetal viability, as well as lower pro-inflammatory response throughout murine gestation. ThesecondChapter discusses how both mutants showed attenuation withgood serological response in rams, non-pregnant ewes and pregnant ewes inoculated by the subcutaneous or conjunctival routes, at different stagesof gestation. Although none of the candidates induced abortions, Rev1∆wzmwas considered safer than 16M∆wzmin pregnant ewes, since the latter showed reactivation of infection at parturition, leading to transient excretion byplacenta/vaginal fluid and/or milk in some animals. Taken together, Chapters 1 and 2 have allowed us to establish a relationship between Brucella multiplication in BeWo trophoblasts and murine placentas, and their ability to induce abortions and transmissionto offspring in ewes inoculated at mid-pregnancy. Also, notwithstandingthe great utility of the pregnant mouse model for selecting safer candidates, the final evaluation of certain safety parameters must be performed in the natural host. Future efficacy and immune response trials in sheep will allow us to determine the actual usefulness of Rev1∆wzm, as an alternative to the current Rev1 vaccine.After verifying the positivevaccinal properties of Rev1∆wzm, in the third Chapter of this Thesis we proposed to construct a mutant in B. suisbv2 to address the control of porcine brucellosis, by constructing and characterizing Bs2Δwzm. This mutant showed distinct biochemical properties from 16M∆wzmor Rev1∆wzm, as well as less attenuation than expected. During these studies, we detected that the parental Bs2 strain exhibited a marked S→R phase instability not previously reported. Furthermore, applying the pregnant mouse model describedin the first Chapter, we studied the placental pathogenesis and immune responseof Bs2 throughout murine pregnancy. Accordingly,this third Chapter was completed with a detailed genetic and phenotypic analysis of the Bs2 strain, with the aim of determining the extent of such phase instability both in vitroand in vivo, and the molecular basis responsible for it. The main results indicated that, in the absence of deletionsor mutations in the wboand wbk genetic regions carrying genes involved in LPS biosynthesis, the variations of the S-LPS to R-LPS in B. suisbv2could be due to variations in bacterial expression, depending on environmental conditions. In fact, cultures with a high degree of bacterial dissociation showed a significant reduction in the expression of genes encoding different mannosyl-and glycosyl-transferases, together with an increase in the expression of the outer membrane protein Omp2b. Due to the complexityof this topic, it has not been possible to determine in this Thesis the exactly molecular mechanisms involved in the spontaneous dissociation of B. suisbv2, so further studies should be performedto understand these mechanisms, their biological implication, and with this, to construct a stable B. suisbv2 strain suitable for vaccine candidates construction against swine brucellosis. One of the most interesting results of this Thesis has been to demonstrate, for the first time, that the dissociation of Bs2 observed in vitrohas an implication in vivo, finding in the same animal bacteria with smoothphenotypes in placental tissues and rough phenotype in splenic tissues of mice. Future studies in pregnant sows will clarifywhether this phenomenon of bacterial adaptation occurs also in the natural host.Contrato de formación de Doctorados Industriales de Gobierno de Navarra (convocatoria 2016), cofinanciado por CSIC y desarrollado en el IdAB. Los trabajos realizados han sido financiados por los proyectos de investigación RTI2018-098658-B-C21 del Ministerio de Ciencia e Innovación (Agencia Estatal de Investigación) y PT068-2018 y PT007 2019 del Departamento de Universidades, Innovación y Transformación Digital de Gobierno de Navarra.Programa de Doctorado en Biotecnología (RD 99/2011)Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011