Polyhydroksialkanoaattien tuotto Saccharomyces cerevisiae -hiivalla

This thesis was inspired by the global need to find replacements for non-biodegradable plastic materials originating from fossil sources. Microbially produced polyhydroxyalkanoates (PHAs) are diverse group of fully biobased and biodegradable polyesters with interesting properties for many applications. However, wide use of PHAs is still hindered by their limited mechanical properties and relatively high costs of sugar feedstocks. This thesis explored possibilities to use lignocellulose derived cellobiose as a carbon source for PHA production in yeast Saccharomyces cerevisiae. In addition, it focused on polymerization of a 2-hydroxacid (D-lactic acid) and controlling PHA copolymer structure in yeast S. cerevisiae with synthetic biology. These approaches contribute to the wider themes of using lignocellulose-based carbon sources for PHA production and improving PHA polymer properties for use in even wider range of different applications in future. Polymerization of 2-hydroxyacids in S. cerevisiae was shown for the first time in Publication 1. As an example, D-lactic was polymerized into poly(D-lactic acid) (PDLA) and copolymer poly(D-lactate-co-3-hydroxybutyrate) [P(LA-3HB)]. D-lactic acid was produced in vivo by ex-ressing ldhA gene from Leuconostoc mesenteroides. Expressed pathways included also either PHA synthase gene phaC1437Ps6-19 from Pseudomonas sp. MBEL 6-19 or phaC1Pre from Pseudomonas resinovorans, both with same four amino acid changes E130D, S325T, S477G, and Q481K. The strains were supplied also with propionyl-CoA transferase genes, either pctMe from Megasphaera elsdenii or engineered pct540Cp from Clostridium propionicum, and with PHB pathway genes phaA, phaB1, and phaC1 from Cupriavidus necator. The highest PDLA accumulation level was 0.73% of the cell dry weight (CDW) and the highest P(LA-3HB) accumulation 3.6% of CDW. Formed polymers had small molecular weights (Mw) of less than 7 kDa and 25 kDa, respectively. The 2-hydroxyacid polymerization was improved in Publication 2 by controlling D-lactic acid production in vivo by adjusting expression of ldhA gene with doxycycline-based Tet-On system. Increase in D-lactic acid production improved PLDA and P(LA-3HB) accumulation in the cells to 5.2% and 19% of CDW, respectively. Adjustable ldhA expression allowed also control of D-lactic acid content in the copolymer from 6 to 92 mol%. In Publication 3, S. cerevisiae was engineered to utilize cellobiose for poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) production. Cellobiose uptake was enabled by expressing cellodextrin transporter gene CDT-1 from Neurospora crassa and either cellobiose phosphorylase gene cbp from Ruminococcus flavefaciens or β-glucosidase gene GH1-1 from N. crassa. Both pathways allowed accumulation of high molecular weight PHB (Mw 450-500 kDa) in S. cerevisiae. The strains expressing GH1-1 consumed cellobiose faster than strains expressing cbp, which lead also to faster growth and PHB accumulation in GH1-1 strains. However, both strains accumulated more PHB on cellobiose (as % of CDW and per consumed sugar) in comparison to control strain grown on glucose. The highest PHB accumulation levels of 13.4±0.9% and 18.5±3.9% PHB of CDW for cbp and GH1-1 strains, respectively, were obtained in pH controlled (pH 6) bioreactor experiments.Biohajoamattomien maaöljypohjaisten muovien tilalle etsitään jatkuvasti uusia ympäristöystävällisempiä materiaaleja. Mikro-organismien tuottamiin polyhydroksialkanoaatteihin (PHA) kuuluu monia erilaisia täysin biohajoavia ja biopohjaisia polyestereitä. Niiden laajempaa käyttöä erilaisissa käyttötarkoituksissa rajoittavat usein kuitenkin sekä niiden heikot mekaaniset ominaisuudet, että sokeripohjaisten hiilenlähteiden korkea hinta. Tässä väitöskirjassa on tutkittu lignoselluloosasta peräisin olevan sellobioosin käyttöä PHA:n tuotossa Saccharomyces cerevisiae -hiivalla. Sen lisäksi työssä on tutkittu 2-hydroksihappojen (D-maitohapon) polymerisaatiota S. cerevisiae -hiivalla ja PHA:n kopolymeerirakenteen säätämistä synteettisen biologian avulla. Nämä tutkimusaiheet edistävät lignoselluloosapohjaisten hiilenlähteiden hyödyntämistä hiivasolukasvatuksissa ja auttavat kehittämään uusia PHA-materiaaleja erilaisia käyttötarkoituksia varten tulevaisuudessa. Julkaisussa 1 esitettiin ensimmäistä kertaa 2-hydroksihappojen polymerisointi S. cerevisiae -hiivassa solujen sisällä. Esimerkkinä kuvattiin D-maitohapon polymerisaatio polymeereiksi poly(D-lactic acid) (PDLA) ja poly(D-lactate-co-3-hydroxybutyrate) [P(LA-3HB)]. D-maitohappo tuotettiin solun sisällä ilmentämällä Leuconostoc mesenteroides -bakteerista peräisin olevaa ldhA-geeniä. PHA:n tuottoa varten soluihin lisättiin bakteeriperäisiä PHA:n tuottoreittejä, joihin jokaiseen kuului yksi PHA-syntaasia määrittävä geeni joko lajista Pseudomonas sp. MBEL 6-19 (geeni phaC1437Ps6-19), Pseudomonas resinovorans (geeni phaC1Pre) tai Cupriavidus necator (geeni PhaC1). Pseudonomas -lajeista peräisin olevat PHA-syntaasit sisälsivät mutaatiot E130D, S325T, S477G ja Q481K. PHA-syntaasien lisäksi soluihin lisättiin myös seuraavia bakteeriperäisiä geenejä monomeerien tuottoa varten: propionyyli-CoA transferaasi -geeni pctMe Megasphaera elsdenii -lajista, muokattu geeni pct540Cp Clostridium propionicum -lajista, sekä polyhydroksibutyraatin (PHB:n) tuottoreitin geenit phaA ja phaB1 C. necator -lajista. Enimmillään solut tuottivat 0.73 % PDLA:ta tai 3.6 %-P(LA-3HB):ta solun kuivapainosta. Muodostuneet polymeerit olivat lyhyitä, niiden molekyylipainot olivat alle 7 kDa ja 25 kDa. D-maitohapon polymerisointia kehitettiin julkaisussa 2. Doksisykliiniin perustuvaa Tet-On -säätelyä käytettiin ldhA-geenin ilmentymisen säätelyyn ja siten myös muodostuvan D-maitohapon määrään hallintaan. D-maitohapon tuoton tehostaminen nosti PDLA ja P(LA-3HB) -tasot solun sisällä enimmillään 5.2 ja 19 %:iin solun kuivapainosta. Se mahdollisti myös D-maitohapon määrän säätelyn kopolymeerissä 6-92 mol % välille. Julkaisussa 3 S. cerevisiae -hiivaan lisättiin reitti sellobioosin hyödyntämistä varten. Samalla tuotettiin poly(3-hydroxybutyraattia) (PHB:ta). Sellobioosireitti sisälsi sellodekstriinin kantajaproteiinin geenin CDT-1 Neurospora crassa -lajista sekä joko sellobioosifosforylaasin geenin cbp Ruminococcus flavefaciens -lajista tai β-glukosidaasin geenin GH1-1 N. crassa -lajista. Tuotetut PHB-polymeerit molemmilla kannoilla olivat pitkiä, noin 450-500 kDa (Mw). GH1-1 -kannat hyödynsivät sellobioosia nopeammin kuin cbp-kannat, minkä vuoksi GH1-1 -kannat myös kasvoivat ja tuottivat PHB:ta nopeammin. Molemmat kannat tuottivat sellobioosilla enemmän PHB:ta kuin vertailukanta glukoosin avulla (suhteutettuna sekä solun kuivapainoon, että kulutettuun sokerimäärään). Isoimmat PHB:n tuottomäärät solun kuivapainosta, 13.4±0.9 % (cbp-kannalla) ja 18.5±3.9 % (GH1-1 -kannalla) mitattiin bioreaktorikasvatuksessa, jossa pH oli säädetty (pH 6)