Cartographie structurale et fonctionnelle de la liaison entre la peptidyl-ARNt hydrolase et son substrat

Peptidyl-tRNA hydrolase (PTH) catalyzes the hydrolysis of peptidyl-tRNA molecules that have prematurely dissociated from the ribosome during protein translation. This protein is essential for bacterial viability whereas its eukaryotic homolog is dispensable. Therefore, PTH is an attractive target for the development of new antibacterials, and it seems important to map the interaction between this protein and its substrate in order to facilitate the design of inhibitors. Because attempts to obtain crystals of PTH with substrate mimics remained unsuccessful, we chose to study such complexes in solution, by NMR spectroscopy. Spectra of 15N-13C uniformly labeled Escherichia coli PTH allowed us to assign the resonance frequencies of the protein backbone atoms and of many side-chain atoms. Then, we analyzed the interaction between PTH and a chemically synthesized small molecule, 3'-(L-[N,N-diacetyl-lysinyl)amino-3'-deoxyadenosine, imitating the 3'-part of a peptidyl-tRNA. This study points out the role of many residues of the active center. In particular, the resulting enzyme-bound substrate model indicates (i) that a phenylalanine residue (Phe66) stacks with the adenine ring of the 3'-terminal adenosine, (ii) that an asparagine residue (Asn114) holds the water molecule involved in the hydrolysis of the substrate and (iii) that another asparagine residue (Asn10) confers to the PTH the capacity to distinguish peptidyl-tRNAs from aminoacyl-tRNAs. We also characterized the interaction between PTH and mini-tRNAs derived from the acceptor end of tRNAHis. These results confirmed the major role of Arg133 and Lys105 residues in the recognition of the 5'-phosphate of tRNA. They also showed an interaction between the C-terminal helix of the protein and the TΨC arm of the tRNA, 30 Å away from the active site. The functional relevance of the latter contact could be established by site-directed mutagenesis. Altogether, our results allow us to propose a complete model of the interaction between PTH and a peptidyl-tRNA.La peptidyl-ARNt hydrolase est une enzyme qui hydrolyse les peptidyl-ARNt issus d'une terminaison prématurée de la traduction. Cette protéine est essentielle à la viabilité des bactéries, mais pas à celle des eucaryotes, ce qui fait d'elle une cible potentielle pour l'action d'anti-bactériens. Cela justifie également qu'on cherche à cartographier l'interaction de cette protéine avec son substrat, pour faciliter la conception d'inhibiteur. Les tentatives d'obtention de cristaux de complexes enzyme:analogue de substrat étant restées vaines, nous avons choisi d'étudier de tels complexes en solution, par RMN. Grâce à un double marquage 15N/13C, nous avons tout d'abord attribué les fréquences de résonance des atomes du squelette de la protéine et d'une grande partie des chaînes latérale. Nous avons ensuite étudié l'interaction entre la PTH d'E. coli et un analogue de son substrat synthétisé chimiquement, la diacétyl-Lys-(3'NH)-adénosine. Cette étude nous a permis de caractériser le rôle de nombreux résidus du site actif, notamment celui d'une phénylalanine (F66) interagissant via son cycle aromatique avec l'adénine 3'-terminale du substrat, celui d'une asparagine (N114) stabilisant une molécule d'eau responsable de l'hydrolyse du substrat et celui d'une autre asparagine (N10) permettant à la PTH de discriminer positivement les peptidyl-ARNt par rapport aux aminoacyl-ARNt. Nous avons aussi étudié l'interaction entre la protéine et des mini-ARNt mimant la tige acceptrice et le bras TΨC d'un ARNt. Ce travail a permis de cartographier la surface de la PTH où l'ARN s'ancre à la protéine. Il a confirmé l'importance de deux résidus basiques, la lysine K105 et l'arginine R133, pour la reconnaissance du phosphate en 5' de l'ARNt. Il a également révélé une interaction entre l'hélice C-terminale de la protéine et le bras TΨC de l'ARNt, à 30 Å du site actif. La pertinence fonctionnelle de ce dernier contact a pu être établie par mutagenèse dirigée. L'ensemble de ces résultats permet de proposer un modèle complet de l'interaction entre la PTH et un peptidyl-ARNt