Maintenance génomique chez l'Archaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi : découverte de nouvelles interactions physiques et caractérisation fonctionnelle

Archaea are micro-organisms present in all ecosystems, but are majoritary present in extremophilic environments. Hyperthermophilic Archaea, as Pyrococcus abyssi, are permanently exposed at temperature which can increase the rate of spontaneous DNA damage. It is probable that hyperthermophilic Archaea possess efficient molecular mechanism to duplicate, maintain and stabilize their genomes. The aim of this project was to investigate the interaction network involved in the process of DNA replication and DNA repair. The methodological approach consists in the coupling of pull-down with mass spectrometry identification of interacting partners. A preliminary interaction network was identified that was composed of new proteins as well as unsuspected interactions between known components of DNA replication machinery. The main results consist in: (1) the nuclease Pab2263, which interacts with PCNA, is a novel player in DNA metabolism. (2) PCNA is likely part of a macrocomplex with the ubiquitary proteins Mre11 and Rad50 suggesting a role of this complex in the repair of double strand break in connection with a replication fork. (3) Fen1 and DNA primase interact physically and can collaborate in vitro to resolve intermediate step of the base excision repair pathway. These results enhance our understanding of DNA repair process in Archaea.Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées