Dérivation de cellules souches pluripotentes à partir de lignées de lapins transgéniques pour le gène hSTAT3-ERT2

L’obtention de cellules souches embryonnaires (ESC) chez le lapin permettrait de développer des techniques de transfert de gènes et de créer des animaux transgéniques modèles de maladies humaines. En effet, le lapin est physiologiquement et génétiquement plus apparenté aux primates que ne l’est la souris et présente de nombreux avantages tels que sa facilité et son faible coût d’élevage, sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Pendant longtemps, le lapin a été une espèce réfractaire à la dérivation des ESC. En effet la dérivation de lignées d’ESC repose sur la capture et la stabilisation in vitro de l’état de pluripotence des cellules du bouton embryonnaire d’un embryon au stade blastocyste. La difficulté réside donc dans la définition des conditions de culture permettant de maintenir cet état de pluripotence des cellules embryonnaires. Depuis 2006, différents groupes ont publié l’obtention d’ESC de lapin, mais les différentes lignées rapportées sont dépendantes du FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) et de l’activine et sont incapables de créer des chimères somatiques et germinales. Ces cellules sont dites dans l’état amorcé de pluripotence, état qui s’oppose à l’état naïf représenté par les ESC de rongeur qui se multiplient en présence de LIF (Leukemia Inhibitory Factor) et de BMP4 (Bone Morphogenic Protein 4) et qui sont à l’origine du développement et de l’utilisation de lignées de souris transgéniques en biologie.Toutes les données actuelles montrent que seules les cellules à l’état naïf peuvent produire des embryons chimériques et la plupart des recherches sur les ESC non-murines sont orientées vers la production de cellules à l’état naïf. Ainsi, la surexpression de différentes combinaisons de facteurs de pluripotence, tels que Oct4, Sox2, Klf2, Nanog et Klf4, a permis d’améliorer l’état de pluripotence des ESC humaines. Dans mon laboratoire d’accueil, la reprogrammation des ESC humaines à l’état naïf a été obtenue par la surexpression d’une forme hormono-dépendante du facteur Stat3 murin. Stat3 est un facteur de signalisation et de transcription qui joue un rôle clé dans le maintien de l’état naïf de pluripotence des ESC murines. Il transfert le signal induit par le LIF jusqu’au noyau de pluripotence composé des trois gènes Oct4, Sox2 et Nanog. Ainsi l’activation par le tamoxifène de la forme hormonodépendante de Stat3, mStat3-ERT2, a permis d’activer la voie LIF/Stat3 dans les ESC humaines et de les rendre indépendantes du FGF2. Afin d’évaluer si un même effet pourrait être obtenu chez le lapin, mon laboratoire d’accueil a créé deux lignées de lapins transgéniques exprimant la protéine humaine STAT3-ERT2. Le but de mon projet d’EPHE a donc été d’évaluer le rôle de Stat3 dans la pluripotence chez le lapin à l’aide de ces lignées transgéniques. Pour cela mon travail a été divisé en 3 parties : 1) la caractérisation et l’entretien des lignées de lapins transgéniques ; 2) la dérivation de lignées d’ESC à partir d’embryons transgéniques ; et 3) l’analyse de l’effet de différents facteurs de croissance sur les embryons transgéniques. Les résultats obtenus montrent d’une part une instabilité inattendu de l’expression du transgène dans les embryons, d’autre part l’absence d’effet de l’activation du facteur hSTAT3-ERT2 dans l’état de pluripotence des ESC dérivées et enfin le manque d’action sur les embryons transgéniques, des facteurs de croissance classiquement utilisés chez les primates pour améliorer l’état de pluripotence des cellules. L’ensemble de ces résultats soutient l’hypothèse que, les voies de signalisation qui activent les mécanismes de maintenance de la pluripotence in vivo comme in vitro diffèrent d’une espèce à l’autre, même si les gènes engagés dans ce phénomène sont très conservés. Il semble donc nécessaire d’étudier les voies de signalisation et les gènes impliqués dans la pluripotence in vivo dans l’embryon de lapin, afin de pouvoir appliquer ces informations à la dérivation d’ESC à l’état naïf chez cette espèce