Affibody-mediated targeting of HER-family receptors for cancer imaging and therapy

Proteins are remarkable molecules with diverse and specialized functions playing essential roles in most biological processes. One such function is protecting us from diseases by the action of antibodies in our immune system that can recognize and mediate the destruction of invading pathogens by binding to foreign epitopes found on non-self proteins. The concept of utilizing specific protein-protein interactions to achieve a therapeutic effect has for several decades been a cornerstone for the development of cancer-directed treatments. While antibodies have formed a basis for the development of such drugs, other protein alternatives may be engineered to complement current antibody-based treatments, and may even prove to possess superior features. This thesis focuses on the engineering of affibody molecules, a small alternative scaffold protein, for design and development of novel cancer-targeting therapeutic and diagnostic drugs. There are many different strategies that have been investigated for inhibiting cancer progression and tumour growth with perhaps one of the most straightforward involving disruption of dysregulated growth-promoting signalling pathways. Members of the human epidermal growth factor receptor (HER) family is prominently expressed in various cancer types and have been shown to be intricately involved in tumorigenesis. One of the members (HER3) often becomes upregulated in cancer and have been shown to mediate acquired resistance to targeted therapies by the mechanism of ligand-induced activation. We have designed five novel affibody-based HER3-targeting molecules able to prevent ligand-binding and consequently activation of HER3. We investigated the targeting properties and biodistribution profiles of these molecules in vivo and subsequently evaluated the anti-tumour efficacy for the most promising variants in direct comparison to a HER3-targeting antibody with a similar inhibitory mechanism. We observed a large influence of design on both the biodistribution properties and the in vivo efficacy of different affibody molecules. Moreover, we demonstrated that two of the affibody-formats were equally effective as the antibody in inhibiting tumour growth and prolonging survival of mice bearing HER3-positive xenografts. The effectiveness of cancer treatments depends on efficient diagnostic approaches that can reliably stratify patients based on these targetable biomarkers, which is possible using radionuclide molecular imaging. We have performed a direct comparison of the diagnostic potential for visualizing HER3-expressing tumours of affibody- and antibody-based imaging probes. We concluded that affibody molecules provide superior imaging quality with higher diagnostic potential and enable early visualization of HER3-expression in tumours. Another member of the HER family that is of interest for cancer therapy is HER1 (or EGFR) but due to substantial expression in healthy tissues, targeted therapies may lead to severe side-effects. One possible solution to this is taking advantage of the distinct milieu of the tumour microenvironment to design EGFR-targeting drugs that become conditionally activated at the tumour site, but not in normal tissues, with the aim of drastically reducing systemic toxicity. We have generated an affibody molecule with anti-idiotypic binding specificity for a previously generated EGFR-binding affibody molecule, which we used to construct an affibody-based prodrug. We were able to show that, in a proof-of-concept format, this anti-idiotypic masking domain was able to block the binding to EGFR until removed by protease-mediated cleavage. We subsequently developed and characterized a more refined version of this prodrug, which we call a pro-affibody, and could show that activation by cancer-associated proteases confers binding to EGFR-expressing cancer cells and enables conditional cytotoxic payload delivery in vitro. The pro-affibody was further evaluated in vivo using tumour-bearing mice to investigate the feasibility for masked uptake in healthy tissues while retaining binding-activity in tumours. We observed a substantial reduction in EGFR-specific liver uptake compared to a control construct without a masking domain, and a strong indication of protease-mediated EGFR-binding in tumours. In conclusion, the experimental work presented in this thesis provides a rationale for designing effective affibody-based cancer therapeutics and diagnostics with different targeting strategies and demonstrates the potential of such drugs from preclinical in vivo data. Proteiner är anmärkningsvärda molekyler med varierande och specialiserade funktioner som spelar ytterst viktiga roller i de flesta biologiska processer. En av dessa funktioner är att skydda oss från sjukdomar genom verkan av antikroppar i vårt immunsystem som kan känna igen och förmedla förstörelsen av invaderande patogener genom att binda till främmande epitoper som finns på icke-självproteiner. Konceptet att använda specifika protein-protein interaktioner för att uppnå en terapeutisk effekt har under flera decennier varit en hörnsten för utvecklingen av cancerriktade behandlingar. Även om antikroppar har utgjort en grund för utvecklingen av sådana läkemedel, kan andra proteinalternativ konstrueras för att komplettera nuvarande antikroppsbaserade behandlingar och kan till och med visa sig ha överlägsna egenskaper. Denna avhandling fokuserar på konstruktionen av målsökande affibody-molekyler, ett litet alternativt protein, för design och utveckling av nya terapeutiska läkemedel och diagnostiska verktyg för cancer. Det finns många olika strategier som har undersökts för att hämma cancerprogression och tumörtillväxt varav ett relativt enkelt tillvägagångsätt involverar störningar av dysreglerade tillväxtfrämjande signalvägar. Medlemmar av den humana epidermala tillväxtfaktorreceptorfamiljen (HER) uttrycks högt i olika cancertyper och har visat sig vara starkt involverade i tumörbildning. En av medlemmarna (HER3) blir ofta uppreglerad i cancer och har visat sig förmedla förvärvad resistens mot riktade terapier genom en mekanism av ligand-inducerad aktivering. Vi har designat fem nya affibody-baserade HER3-bindande molekyler som kan förhindra ligandbindning och följaktligen aktivering av HER3. Vi undersökte bindningsegenskaperna och biodistributionsprofilerna för dessa molekyler in vivo och utvärderade därefter antitumöreffektiviteten för de mest lovande varianterna i direkt jämförelse med en HER3-riktad antikropp med en liknande hämmande mekanism. Vi observerade ett stort inflytande av design på både biodistributionsegenskaperna och in vivo-effekten av de olika affibody-molekylerna. Dessutom visade vi att två av affibody-formaten var lika effektiva som antikroppen i att hämma tumörtillväxt och förlänga överlevnaden för möss som bär HER3-positiva xenotransplantat. Effektiviteten av cancerbehandlingar beror på kraftfulla diagnostiska metoder som på ett tillförlitligt sätt kan stratifiera patienter baserat på dessa biomarkörer, vilket är möjligt med hjälp av radionuklidavbildning. Vi har utfört en direkt jämförelse av den diagnostiska potentialen för att visualisera HER3-uttryckande tumörer med affibody- och antikroppsbaserade avbildningsprober. Vår slutsats var att affibody-molekyler ger överlägsen bildkvalitet med högre diagnostisk potential och möjliggör tidig visualisering av HER3-uttryck i tumörer. En annan medlem av HER-familjen som är av intresse för cancerterapi är HER1 (eller EGFR), men på grund av betydande uttryck i friska vävnader kan riktade terapier ofta leda till allvarliga biverkningar. En möjlig lösning på detta är att dra fördel av den distinkta tumörmikromiljön för att designa EGFR-inriktade läkemedel som blir villkorligt aktiverade i tumören, men inte i normala vävnader, i syfte att drastiskt minska systemisk toxicitet. Vi har genererat en affibody-molekyl med anti-idiotypisk bindningsspecificitet för en tidigare genererad EGFR-bindande affibody-molekyl som vi använde för att konstruera en affibody-baserad prodrogmolekyl. Vi kunde visa att, i ett "proof-of-concept" format, denna anti-idiotypiska maskeringsdomän blockerade bindningen till EGFR tills den avlägsnades genom proteasmedierad klyvning. Därefter utvecklade och karakteriserade vi en mer förfinad version av denna prodrog, som vi kallar en pro-affibody, och kunde visa att aktivering förmedlad av cancerassocierade proteaser medför bindning till EGFR-uttryckande cancerceller och möjliggör villkorad leverans av cytotoxiska molekyler in vitro. Pro-affibody molekylen utvärderades ytterligare in vivo med användning av tumörbärande möss för att undersöka möjligheten för maskerat upptag i friska vävnader samtidigt som bindningsaktiviteten bibehålls i tumörer. Vi observerade en avsevärd minskning av EGFR-specifikt leverupptag jämfört med ett kontrollprotein utan maskeringsdomän, och en stark indikation om proteasmedierad EGFR-bindning i tumörer. Sammanfattningsvis ger det experimentella arbetet som presenteras i denna avhandling en rational för att designa olika strategier för effektiv affibody-baserad cancerterapi och diagnostik och demonstrerar potentialen av sådana läkemedel från prekliniska in vivo-data.QC 2022-03-08