Mykobakteerien antibioottitoleranssi seeprakalamallissa

Opinnäytetyö toteutettiin Tampereen yliopiston lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunnan infektiobiologian tutkimusryhmässä. Ryhmä tutkii tuberkuloosia ja sitä aiheuttavan mykobakteerin ominaisuuksia ja pyrkii löytämään entistä tehokkaampia hoitomuotoja tuberkuloosia vastaan. Vuonna 2020 Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttamaan tuberkuloosiin kuoli globaalisti 1,5 miljoonaa ihmistä ja arviolta 10 miljoonaa ihmistä sairastui tautiin. Tuberkuloosin hoidossa suurin haaste on antibioottihoidon hitaus ja monilääkeresistentti tuberkuloosi, joka on vakava uhka terveydenhoidolle. Taudin hoitoon käytetään normaalisti neljää tai viittä eri antibioottia jopa kuuden kuukauden hoitojakson ajan. Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia, vaikuttaako adaptiivinen immuunivaste antibioottitoleranssiin. Adaptiivinen immuunivaste aiheuttaa stressiä bakteereille, jolloin bakteeri menee todennäköisemmin matalan metabolian tilaan suojautuakseen antibiootilta. Näin adaptiivinen immuunivaste voisi lisätä antibioottitoleranssia ja heikentää antibioottihoidon tehoa. Hypoteesin mukaan rag1-mutanttiseeprakalalinjan infektion hoitaminen olisi tehokkaampaa kuin infektion hoitaminen kontrolliryhmiltä, sillä mutantti ei omaa adaptiivista immuunivastetta. Kontrolliryhminä toimi rag-villityypin kalalinja sekä AB-linja, joilta molemmilta löytyy adaptiivinen immuunivaste. Opinnäytetyön tarkoituksena oli infektoida seeprakalaryhmiä M. marinum -bakteerilla, joista osa hoidettiin rifampisiini- ja moksifloksasiiniantibioottihoidolla ja loput olivat hoitamattomia kontrolliryhmiä. Ryhmistä kerättiin näytteitä eri viikkojen aikapisteissä ja näytteet käsiteltiin kaupallisella BBL® MycoPrep™ -menetelmällä. Tulokset saatiin laskemalla bakteeripesäkkeiden määrät 7H10-agarmaljoilta inkuboinnin jälkeen. Tulosten käsittelyssä käytettiin graafisia ja tilastollisia menetelmiä. Tuloksista huomattiin, että immuunipuutteisen rag-kalalinjan infektion hoito antibiooteilla ei ollut tehokkaampaa kuin muilla kalaryhmillä. Kaikki ryhmät näyttivät siis yhtä antibioottitoleranteilta. Tämä viittaisi siihen, että antibioottitoleranssi syntyi jo pelkän antibiootin läsnäolosta ja myös synnynnäinen immuniteetti on voinut vaikuttaa tuloksiin. Nämä tekijät yhdessä tai erikseen aiheuttivat antibioottitoleranssin fenotyypin koe-elämissä. Adaptiivisen immuniteetin roolin tutkimista mykobakteeri-infektion hoidossa ei tulosten pohjalta kannata enää jatkaa. Mycobacterium tuberculosis -infektion hoitoon ihmisessä ei voida näiden tulosten perusteella vaikuttaa adaptiivisen immuniteetin kautta.This thesis was done in the Infection Biology research group within Tampere University faculty of Medicine and Health Technology. A research group is researching tuberculosis and the characteristics of its pathogen mycobacteria, and the goal is to find more effective forms of treatment against the disease. In 2020, 1.5 million people died globally from tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis bacteria, and it is estimated that around 10 million people contracted the disease. The greatest challenges in tuberculosis treatment are its slowness and multidrug-resistant tuberculosis which is a serious threat to health care. Nowadays tuberculosis is treated with four or five antibiotics for up to six months. The object of the thesis was to study whether the adaptive immune response affects antibiotic tolerance. Adaptive immune response causes stress to the bacteria and the bacterium is more likely to go to into low metabolic state to protect itself from the antibiotic. Thus, antibiotic tolerance could increase and weaken the efficacy of antibiotic treatment. The hypothesis was that antibiotic treatment of rag1 mutant zebrafish could be more effective than control groups because the mutant does not have an adaptive immunity response phenotype. AB and rag wild-type fish groups act as control groups for the experiment which both possess adaptive immunity response. The purpose of the thesis was to infect zebrafish lines with M. marinum bacteria. A part of the groups were treated with rifampicin and moxifloxacin antibiotics and the rest were untreated control groups. Samples were collected from each of the groups in different weeks’ time points and they were treated with the commercial BBL® MycoPrep™ system. Results were counted in the bacteria colonies in the 7H10 Agar plates after the incubation period. The results showed that antibiotic treatment in immunocompromised rag fishlines was not any more effective than in the rest of the groups. All the groups were as tolerant to the antibiotic as the rag group. This could indicate that even the presence of the antibiotic could create antibiotic tolerance or innate immunity could have affected the results. These characteristics, combined or individually, could have been causing the antibiotic tolerance in the zebrafish. Based on these results there is no need to continue researching the adaptive immunity response to treat mycobacteria infection. The results indicate that treating human Mycobacterium tuberculosis infection cannot be enhanced via adaptive immunity. Graphical and statistical methods were used to process the results