Metabolismus und Toxizität von 2-Methylfuran

2-Methylfuran (MF) ist eine Kontaminante, die vor allem in hitzebehandelten Lebensmitteln wie Kaffee oder Lebensmittelkonserven vorkommt. Jedoch ist die Datenlage für eine Risikobewertung lückenhaft hinsichtlich der Exposition und Toxizität (Knutsen et al., 2017). In vivo Studien mit 14C-MF zeigten die Leber als Zielorgan histopathologischer Veränderungen, wie Nekrosen (Ravindranath et al., 1986; Gill et al., 2014). Es wurde die metabolische Aktivierung von MF zu reaktivem Acetylacrolein (AcA) angenommen, welches ein hohes Potential zeigte an Aminosäuren zu binden (Ravindranath et al., 1984a; Ravindranath und Boyd, 1985). In dieser Arbeit wurden die molekularen und chemischen Mechanismen von MF und AcA untersucht, um Rückschlüsse auf die toxikologischen Effekte zu ermöglichen. Zunächst wurde MF in silico hinsichtlich seines toxikologischen Potentials klassifiziert und endpunktspezifisch quantitative Struktur-Wirkungsbeziehungen (QSAR, engl. quantitative structure-activity relationship) analysiert. Positive toxikologische Abschätzungen basierten auf dessen metabolischer Aktivierung zu verschiedenen Metabolite. Diese wurden in zwei Gruppen unterteilt, welche von AcA oder Furfurylalkohol (FFA) abstammten. Im Folgenden wurde AcA synthetisiert und dessen Reaktivität gegenüber N-Acetyl-L-cystein (AcCys), Nα-Acetyl-L-lysin (AcLys), 2′-Desoxyadenosin (dA), 2′-Desoxyguanosin (dG), 2′-Desoxycytosin (dC) sowie 2′-Desoxythymidin (dT) geprüft. Bis auf dT, welches keine Reaktivität zeigte, wurden alle Addukte von AcA charakterisiert, was die Entwicklung sensitiver Quantifizierungsmethoden via (U)HPLC-ESI+/--MS/MS ermöglichte. Anschließend wurde die metabolische Aktivierung von MF zu AcA unter Verwendung humaner (HLM) und Rattenlebermikrosomen (RLM) verifiziert und enzymkinetisch untersucht. Analog wurde die Umsetzung von MF mit CYP 2E1 charakterisiert, welches sich innerhalb der getesteten SupersomesTM CYP 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1 und 3A4 als Schlüsselenzym herausstellte. Zuletzt wurde die Bildung der in chemico identifizierten AcA-Addukte in vitro untersucht. Hierzu wurde die Zytotoxizität von MF in primären Rattenhepatozyten (pRH) mit der in HepG2-Zellen verglichen als auch in Bezug zu der Zytotoxizität von AcA gesetzt. Wurden pRH mit MF und AcA inkubiert, konnte in den Zellüberständen AcLys-AcA zeit- und dosisabhängig nachgewiesen werden. Dies qualifiziert AcLys-AcA als potenzieller Biomarker. Gleichzeitig konnte hiermit gezeigt werden, dass AcA auch auf zellulärer Ebene gebildet wird. Dahingegen wurde weder AcCys-AcA noch die DNA-Addukte dA-AcA, dG-AcA oder dC-AcA in vitro nachgewiesen. Dies deutete auf eine effiziente Detoxifzierung, bzw. Reaktion mit Biomolekülen in der Zelle hin, obgleich die Induktion anderer DNA-Schäden, ggf. auch durch anderen Metabolit, nicht prinzipiell auszuschließen ist. So wurde erstmals in vitro AcA als reaktiver Metabolit von MF nachgewiesen und seine Addukte mit nukleophilen Zellbestandteilen als potenzielle Biomarker untersucht. Diese ermöglicht eine verbesserte Risikobewertung von MF.2-Methylfuran (MF) is a contaminant found primarily in heat-treated foods such as coffee or canned food. However, the data for risk assessment is not only incomplete in terms of exposure but also in terms of toxicity (Knutsen et al., 2017). In vivo studies with 14C-MF indicate that the liver is the target organ for histopathological changes, such as necrosis (Ravindranath et al., 1986; Gill et al., 2014). The metabolic activation of MF to the reactive intermediate acetylacrolein (AcA), which showed high potential to bind to amino acids, was assumed to be the fundamental cause (Ravindranath et al., 1984a; Ravindranath and Boyd, 1985). In this thesis, the molecular and chemical mechanisms of MF and AcA were investigated to draw conclusions about the toxicological effects of MF. To determine the toxicological potential of MF based on its structure, MF was first categorized and its endpoint-specific quantitative structure-activity relationships (QSAR) were analyzed in silico. Positive estimates were based on its metabolic activation to different metabolites, which were then divided into two groups derived from AcA or furfuryl alcohol (FFA). Based on the insights of the in silico analyses and existing literature, AcA was synthesized for further investigation as the most prominent metabolite. That enabled the testing of its reactivity toward N-acetyl-L-cysteine (AcCys), Nα-acetyl-L-lysine (AcLys), 2′-deoxyadenosine (dA), 2′-deoxyguanosine (dG), 2′-deoxycytosine (dC), and 2′-deoxythymidine (dT). Except for dT, which showed no reactivity, all adducts were characterized, allowing the development of sensitive quantification methods via (U)HPLC-MS/MS. In the next step, the metabolic activation of MF to AcA was verified using human (HLM) as well as rat liver microsomes (RLM) and characterized by enzyme kinetics. This was also possible for conversion with CYP 2E1, which was found to be a key enzyme within the tested supersomesTM CYP 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1 and 3A4. The final part of this thesis focused on the formation of the defined AcA adducts in vitro. For this purpose, the cytotoxicity of MF in primary rat hepatocytes (pRH) and HepG2 cells was compared, before it was related to AcA in pRH. When pRH were incubated with MF and AcA, AcLys-AcA was detected in the cell supernatants in a time- and dose-dependent manner. Thus, AcLys-AcA qualifies as a potential biomarker. In addition, the results showed that AcA was indeed formed at the cellular level. Neither AcCys-AcA nor the DNA adducts dA-AcA, dG-AcA or dC-AcA were detected after in vitro incubations. This indicated efficient detoxification, or reaction with biomolecules in cells. Although induction of other DNA damage, possibly by other side metabolites, cannot be generally excluded. In summary AcA was determined as a reactive metabolite of MF in vitro, its adduct formations with nucleophilic cellular components were characterized and investigated as potential biomarker in vitro for the first time. These results improve the risk assessment of MF