Activateurs de plasminogène et résorption osseuse

Le rôle des activateurs de plasminogène dans les processus de résorption osseuse est jusqu’à ce jour sujet à spéculations. Il est clairement établi que ces processus complexes sont dépendants d’une part du recrutement, de la migration et de l’activation de précurseurs de cellules ostéoclastiques à partir des vaisseaux sanguins jusqu’aux surfaces osseuses minéralisées et que le système activateur de plasminogène / plasmide est impliquée dans les processus de migration de nombreux types cellulaires physiologiques ou pathologiques. D’autre part, ces processus sont aussi dépendants de l’action d’une enzyme spécifique, la collagénase, sécrétée sous une forme latente activable par la plasmine. au vu de ces données, nous avons tout d’abord analysé la production d’activateur de plasminogène au sein d’un tissu osseux intact dans lequel la résorption est induite par le PTH ou inhibée par la calcitonine. Les résultats obtenus lors de culture de calvariae de souris embryonnaires de 19 jours ont validé, au niveau du tissu osseux, les observations de stimulation du t-PA par la PTH réalisées dans des systèmes de culture de cellules ostéoblastiques isolées. Ils ont montré de plus que cette activité d’activateur de plasminogène de type tissulaire, t-PA, stimulée par le PTH est à 98% associée au tissu même, qu’elle suit une courbe de stimulation similaire à celle d’autres paramètres de la résorption mais que contrairement à celle-ci elle n’est pas inhibée par la calcitonine et qu’enfin, elle s’accompagne de la libération dans les milieux conditionnés d’une faible activité de type urokinase. Considérant les hypothèses émises quant aux rôles éventuels de ces activateurs lors des processus de résorption, c’est-à-dire, soit un rôle dans les phases préalables à la résorption lors des étapes de recrutement et de migration des précurseurs d’ostéoclastes soit un rôle dans l’activation de la procollagénase , nous avons tenté d’établir la signification physiologique des premiers résultats et en particulier, nous avons recherché si l’activation du plasminogène en plasmine est nécessaire soit aux phénomènes préparatoires à la résorption (recrutement et migration des précurseurs d’ostéoclastes) soit à al résorption ostéoclastique proprement dite. En utilisant un modèle de culture de métatarses de souris fœtales au 17ème jour de leur développement, décrit par Burger (1982), nous disposions d’un système de culture dans lequel la phase de résorption ostéoclatique proprement dite est totalement dépendante d’une phase préparatoire. Après avoir adapté ce modèle à nos conditions de culture en milieu liquide plutôt qu’en milieu semi-solide, nous l’avons caractérisé par l’usage d’agent s hormonaux ou pharmacologiques connus pour être des inducteurs (PTH, vit. D) ou des inhibiteurs (calcitonine, NaF, biphosphonate) de résorption osseuse. Nous avons ensuite analysé les activateurs de plasminogène et observé que l’u-PA est l’activateur majeur produit par les métatarses entiers de même que par les diaphyses considérées isolément. Finalement, nous avons entrepris d’évaluer le rôle du système activateur de plasminogène / plasmine dans la résorption osseuse par le biais d’expériences visant soit à inhiber l’activité de la plasmine par addition d’inhibiteurs physiologiques ou pharmacologiques soit à dépléter le système de culture en plasminogène. Les résultats obtenus semblent bien exclure la nécessité de l’activation du plasminogène en plasmine pour le bon déroulement des diverses étapes qui, faisant suite à l’extravasation des précurseurs d’ostéoclastes au niveau du périoste, aboutissent à la résorption de l’os par des ostéoclastes matures. Il reste cependant à établir la signification physiologique de la forte stimulation de la production de t-PA obtenue dans le tissu osseux (calvariae) sous l’effet des agents inducteurs de résorption, - une réponse due sans doute essentiellement aux ostéoblastes. Cette signification pourrait bien se trouver dans des effets qui se manifestent indépendamment de la présence de plasminogène et de l’activité catalytique de la plasmineStudies on culture of isolated osteoblasts have established that various bone-resorbing hormones increase the expression of tissue plasminogen activator (t-PA) by these cells. The bone resorption processes are known to be dependent, on the one hand, on the recruitment and the migration of osteoclast precursor cells from the blood vessels to mineralized bone surfaces and it is known also that the plasminogen activator / plasmin cascade may be involved in some physiological or pathological cell migrations. On the other hand, bone resorption requires the action of collagenase, released as an inactive precursor, procollagonase, and this zymogen is known to be activatable by plasmin. On this basis, it may thus be speculated that Pas might participate in the bone resorption processes. In the present work, we first investigated the production of Pas that may occur in organized bone tissue which resorption was induced by PTH or inhibited by calcitonin. The results obtained from culture of 19 day-old fetal mouse calvariae have validated, at the level of explanted bone tissue, the observations on the PTH induction of t-PA done previously in culture systems of isolated osteoblast-like cells. In our studies, tissue (t-PA, 70 kD) and urokinase (u-PA, 48 kD) type PA were detected essentially in the tissue extracts of the explanted bones, with only 1-2% of the total activity released in the surrounding culture media. PTH induced bone resorption and stimulated in parallel the accumulation of PA in the tissue; other bone-reosrbing agents, 1.25-dihydroxyvitamin D3 and prostaglandin E2, had similar effects. Densitometric scanning if the zymograms of the bone extracts indicated that PTH stimulated only the production of t-PA and had no effect on that of u-PA. However, PTH also enhanced the release of the u-PA (both the 48 kD and the 29 kD forms) from the bones into the media. Although inhibiting bone resorption, calcitonin had no effect on the PTH-induced accumulation of PA in bone or on the release of t-PA, but it prevented the PTH-induced accumulation of 29 kD u-PA in the culture fluids. Thus these studies support the view that t-PA and possibly also u-PA may have a role in the physiology of bone. In a second series of experiments, we tried to establish the physiological significance of these findings and particularly to evaluate whether the activation of plasminogen into plasmin is necessary for either the preliminary phases to bone resorption (recruitment and migration of osteoclast precursor cells) or the actual bone resorption processes. At the time of explantation, the calvaria used in our first series of experiments contain already osteoclasts in contact with mineralized bone surfaces and are thus not suitable t study possible interferences with the preparatory phases of resorption. Therefore a model was used that involved 17 day-old fetal mouse metatarsals that were explanted and cultured under conditions in which they pursue in vitro for a few days their normal bone remodeling. As described by Burger (1982), the osteoclastic resorption phase is, in this model, totally dependent of a preparatory phase of osteoclasts in their mineralized zones but contain the osteoclast mononuclear precursors in their periosteum. These precursors then migrate from the periosteum through the bone collar and into the calcified cartilage, where they further differentiate into active multinuclear osteoclasts and resorb the mineralized matrix. Of the mineral has been prelabeled in the culture medium. This model was adapted first to our culture conditions, particularly to the use of a liquid medium. It was then characterized with the use of various agents known to be either inducers (PTH, vit. D) or inhibitors (calcitonin, NaF, bisphosphonates) of bone resorption. We further analyzed the PAs present in the explants and observed that u-PA is the main PA present in the whole metatarsals or in their diaphysis. Zymograms indicated however that t-PA contrary to u-PA, is significantly stimulated by PTH, as had been observed already in the calvaria model. We investigated the possible involvement of the PA / plasmin cascade in the bone resorption processes by culturing the metatarsals either under conditions in which plasmin activity was inhibited by physiological (α2-antiplasmin, α1-antiplasmin) or pharmacological (aprotinin) inhibitors or under conditions in which plasminogen was depleted from the system. Our results led us to conclude that plasminogen activation and plasmin activity are not necessary to allow the normal evolution of the different stages of the resorptive processes which follow the extravasation of osteoclast precursor cells in the periosteum and end up with the osteoclastic resorption o the mineralized matrix. The physiological significance of the PTH-induced t-PA accumulation observed in bone tissue ion our cultures remains thus to be established. Its role may possibly be related to PA effects independent of either plasminogen presence or plasmin activityThèse de doctorat en sciences biomédicales (biochimie - biologie cellulaire) -- UCL, 199