Etude de l'activation de la 6-phosphofructo-2-kisase cardiaque par l'insuline

The stimulation of heart glycolysis by insulin is due to an increase in glucose transport and to activation of 6-phosphofructo-2-linase (PFK-2), the enzyme responsible for fructose 2,6-biphosphate (Fr u-2 ,6-P2) synthesis. Fru-2,6-P2 is a potent stimulator of 6-phosphofructo-1-kinase, a key enzyme of glycolysis. The activation of PFK-2 by insulin is sensitive to wortmannin, a phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) inhibitor, but is not blocked by rapamycin, which prevents p70 ribosomal S6 kinase activation. A good candidate for mediating the insulin-induced activation of PFK-2 is therefore protein-kinase B (PKB), which is located downstream of PI 3-kinase in the insulin signalling pathways. PFK-2 was indeed found to be a substrate of PKB. The phosphorylation sites for PKB in PFK-2 were identified as Ser-466 and Ser-483. The phosphorylation of Ser-466 doubled the Vmax of PFK-2, whereas phosphorylation of Ser-483 increased the IC50 for citrate inhibition. Phosphorylation of both residues was required to decrease by half the Km for fructose 6-phosphate (Fru-6-P). The time-course of PKB and PFK-2 activation by insulin was studied in isolated cardiomyocytes and in perfused hearts. The insulin-induced activation of both enzymes was concomitant and maximal within a few minutes. This is consistent with a role for PKB in the activation of PFK-2 by insulin. We also studied the insulin-induced activation of heart PFK-2 in transfection experiments on human embryonic kidney 293 cells. Insulin activated transfected PFK-2 by phosphorylation Ser-466 and Ser-483, the same sites phosphorylated by PKB “in vitro”. Cotransfected kinase-dead (KD) PKB or KD 3-phosphoinositide-dependent kinase -1 (PDK-1) acted as dominant negatives, because both prevented the insulin-induced activation of PKB and the inactivation of glycogen synthase kinase-3. However, the insulin-induced activation of PFK-2 was prevented only by KD PDK-1, but not by KD PKB. These results suggest that the insulin-induced activation of heart PFK-2 is mediated by a PDK-1 activated protein-kinase other than PKB. We partially purified a wortmannin-sensitive and insulin-stimulated protein-kinase from perfused hearts, which we call WISK. WISK was devoid of PDK-1, PKB, serum and glucocorticoids-regulated protein-kinase and protein kinase Cζ (PKCζ). WISK phosphorylated Ser-466 to a greater extent than Ser-483 and increased the Vmax of PFK-2 2-fold, without affecting the Km for Fru-6-P. Treatment of WISK with protein-phosphatase 2A (PP2A) reversed the effect of insulin, suggesting the involvement of an upstream activating kinase. Indeed, PDK1 was able to partially reactivate PP2A-treated WISK and this reactivation was not enhanced by PtdIns(3,4,5,)P3. Gel filtration, in-gel kinase analysis and phosphorylation by [γ-32P] ATP in the presence of PDK-1 indicated that WISK was a monomer with a Mr of 57000. These findings provide evidence for the existence of a new protein-kinase in the insulin signalling pathway downstream of PDK1, which phopshorylates and activate PFK-2La stimulation de la glycolyse cardiaque par l’insuline résulte essentiellement d’une augmentation du transport du glucose et d’une activation de la 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), l’enzyme responsable de la synthèse du fructose-2,6-biphosphate (Fru-2,6-P2). Le Fru-2,6-P2 est l’effecteur le plus puissant de la 6-phosphofructokinase, une enzyme clé de la glycolyse. L’activation de la PFK-2 par l’insuline est bloquée par la wortmannine, une inhibiteur de la Phosphotidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase), mais pas par la rapamycine qui empêche l’activation de protéine-kinase de 70 KDa phosphorylant la sous-unité S6 du ribosome. Un premier candidat situé en aval de la PI 3-kinase et capable d’activer la PFK-2 est la protéine-kinase B (PKB). En effet, la PFK-2 est activée « in vitro » par la PKB qui phosphoryle la Ser-466 et la Ser-483. La phosphorylation de la Ser-466 augmente la Vmax, celle de la Ser-483 lève l’inhibition par le citrate, et la phosphorylation des deux sites augmente l’affinité de la PFK-2, pour le fructose-6-phosphate. La cinétique d’activation par l’insuline de la PFK-2 et de la PKB dans le cœur perfusé et les cardiomyocytes isolés est concomitante et maximale endéans les premières minutes. Ceci renforce l’hypothèse que la PKB intervient dans l’activation de la PFK-2 par l’insuline. Dans les cellules embryonnaires rénales 293 exprimant le PFK-2 transfectée, la phosphorylation de la Ser-466 et de la Ser-483 observée après stimulation par l’insuline est identique à celle observée « in vitro » avec la PKB. Cependant, dans ces cellules, les expériences de tranfection de la PFK-2 avec un dominant négatif de la PKB n’empêchent pas l’activation de la PFK-2 par l’insuline, bien que ce dominant négatif empêche l’activation de la PKB et l’inactivation de la glycogène synthase kinase 3. Enfin, un dominant négatif de la protéine-kinase dépendante des 3-phosphoinositides (PDK-1) empêche l’activation de la PFK-2 par l’insuline. Nos résultats obtenus dans ce modèle confirment le rôle essentiel de la PDK-1 mais remettent en question le rôle primordial joué par la PKB dans ‘l’activation de la PFK-2 par l’insuline. Dès lors, nous avons purifié partiellement à partir de cœurs perfusés une protéine-kinase activée par l’insuline et dont l’activation est inhibée par la wortmannine que nous avons appelée WISK (pour « Wortmannin-sensitive and Insulin Stimulated protein-kinase »). WISK est différente de la PDK-1n de la PKB, de la protéine-kinase régulée par le serum et les glucocorticoïdes et de la protéine-kinase Cζ. WISK augmente la Vmax de la PFK-2 et partiellement réactivée par phosphorylation en présence de PDK-1. Cette réactivation par la PDK-1 n’est pas stimulée par les 3-phosphoinositides. WISK est un monomère de masse moléculaire de 57000 ainsi que l’indiquent la filtration sur tamis moléculaire, les expériences de phosphorylation par l’ATP[γ-32P] en présence de la PDK-1 et de renaturation de la protéine-kinase en gel SDS-PAGE. WISK semble donc une nouvelle protéine-kinase située en aval de la PDK-1 et qui est capable d’activer la PFK-2 cardiaque par phosphorylationThèse de doctorat en sciences biomédicales -- UCL, 200