Optimalisering av RNA-analyser; utprøving av Epstein-Barr virus-transformerte lymfoblastoide cellelinjer som kontrollmateriale

Avdeling for medisinsk genetikk (AMG) på St. Olavs Hospital har behov for nytt kontrollmateriale til analyser av RNA. Gentesting kan utføres på RNA-nivå som et supplement til gentesting på DNA-nivå. Dette utføres som regel ved sekvensering av cDNA, og det er nødvendig med en normal kontroll som behandles på lik måte som pasientprøvene. Årsaken er at kontrollen skal kunne brukes som en referanse for pasientprøver. En referansesekvens er viktig fordi messenger-RNA (mRNA) kan settes sammen på ulike måter ved alternativ spleising og danne ulike transkripter. Dette kan forstyrre analyseringen ved at transkriptene danner en bakgrunnssekvens som kan forveksles med patogene varianter. Denne oppgaven tar for seg en uttesting av humane lymfoblastoide B-cellelinjer fra Coriell Institutt i USA, for å finne ut om de kan brukes som normal kontroll. I forkant av bachelorprosjektet ble cellelinjene dyrket ved Institutt for Klinisk og molekylær medisin. Videre ble lymfocyttene dyrket i korttidskultur av ansatte ved AMG. RNA ble isolert fra lymfocyttene og cDNA-syntese ble utført. Vår oppgave har vært å amplifisere cDNA ved bruk av PCR og deretter sangersekvensere produktet for å identifisere baserekkefølgen. Sekvensene til cellelinjene har blitt sammenlignet med sekvensene til normale pasientprøver. Gelelektroforese ble utført som et kontrolltrinn underveis for å sikre at nok cDNA ble amplifisert ved PCR. Resultatene viser at cellelinjene oppfører seg som normale pasientprøver ved at de viser de samme transkriptene og benigne variantene. Det er grunn til å tro at konsentrasjonen av RNA ikke har betydning for signalstyrke og kvalitet på sekvensene, men at RIN-verdi er mer avgjørende. Resultatene er basert på analyser av genene NF1 og PTCH1, og de gir grunnlag for å gå videre med analysering av flere aktuelle gener. Videre må avdelingen validere cellelinjene for å kunne ta de i bruk som kontrollmateriale