Síntese e determinação da estrutura de peptídeos antimicrobianos intragênicos de proteínas humanas

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2022.O aumento da resistência aos antibióticos tem motivado a busca por novos fármacos com atividade antimicrobiana. Peptídeos são considerados uma alternativa promissora em virtude das vantagens inerentes a eles, como ação contra diversos microrganismos e a possibilidade de sinergismo com outros compostos. Estudos recentes mostram que determinadas sequências de aminoácidos encriptadas em proteínas, quando isoladas, podem apresentar atividades biológicas, como atividade antimicrobiana, que não manifestavam enquanto parte estrutural das proteínas precursoras. Assim, este trabalho tem como objetivo prospectar, caracterizar e determinar a estrutura tridimensional (3D) de peptídeos intragênicos com ação antimicrobiana e baixa citotoxicidade. Inicialmente, o peptídeo Hs02, oriundo de uma proteína humana, que teve sua atividade antimicrobiana comprovada em estudos anteriores, foi submetido à Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a determinação da sua estrutura 3D. Por meio dos experimentos 2D 1H1H TOCSY e 1H1H NOESY foi possível verificar que, na presença de micelas de DPC-d38, o peptídeo Hs02 adquire uma estrutura helicoidal anfipática bem definida entre os resíduos 3 e 14, com uma face polar composta por resíduos carregados positivamente. Foi observada ainda flexibilidade estrutural na porção N-terminal, especialmente na cadeia lateral do Triptofano 2, que pode estar interagindo com a membrana microbiana por meio de interações do tipo cátion-pi. Como proteínas humanas demonstraram ser uma boa fonte de fragmentos bioativos, cerca de 80 proteínas superexpressas no organismo humano durante infecções foram analisadas com o auxílio do programa Kamal - desenvolvido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - com o intuito de encontrar sequências de aminoácidos com características físicoquímicas semelhantes as observadas em peptídeos antimicrobianos (PAMs). Foram selecionados 5 peptídeos, com possível estrutura em α-hélice (H05, H06, H07, H08 e H09) para síntese em fase sólida e purificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Esses peptídeos tiveram sua identidade confirmada por Espectrometria de Massa (EM) e foram submetidos a ensaios antimicrobianos. Entretanto, não apresentaram atividade antimicrobiana na faixa de concentração avaliada. Em seguida, a metodologia de prospecção foi adaptada para buscar peptídeos curtos similares a estruturas folha-β. O fragmento encontrado, denominado Hs10, demonstrou ser uma alternativa promissora, visto que apresenta atividade antimicrobiana, baixa citotoxicidade e é composto por apenas 9 resíduos de aminoácidos. Além disso, ensaios de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), Espalhamento de Luz (DLS) indicaram que o lipopolissacarídeo (LPS) presente na membrana externa de bactérias Gram-negativas está intimamente ligado ao mecanismo de ação do Hs10, e que a interação entre essas moléculas se dá principalmente por interações eletrostáticas. Estudos conformacionais por CD sugerem ainda que na presença de membranas biomiméticas aniônicas, as moléculas de Hs10 se organizam de maneira a formar uma estrutura anfipática similar a uma folha-β. Por fim, estudos realizados por meio da técnica de RMN indicam que o Hs10 tende a se estruturar na presença de uma pequena concentração de LPS, resultando em uma família de estruturas convergentes.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The increase of the antibiotic resistance has motivated the exploration of new drugs with antimicrobial activity. Peptides have been considered as a promising alternative for that because of their inherent advantages, such as action against various microorganisms and possibility of synergism with other compounds. Recent studies have shown that certain amino acid sequences encoded in proteins can exhibit new properties, such as antimicrobial activity, which is not displayed by the precursor protein. Thus, this work aims to prospect, characterize and determine the 3D structure of intragenic peptides with antimicrobial action and low toxicity. Initially, the Hs02, a peptide from human protein, which had its antimicrobial activity proven in previous studies, was evaluated by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) with the aim to determine its structure. The 2D 1H1H TOCSY e 1H1H NOESY experiments verified that Hs02 forms a welldefined amphiphilic helical structure between residues 3 and 14 in the presence of DPC-d38 biomimetic membranes. Moreover, its polar face is composed predominantly by positively charged residues. The structural flexibility was also observed in the N-terminal portion, especially in the Tryptophan 2 sidechain residue, which may provide a cation-pi interaction between this peptide and the microbial membrane. As human proteins proved to be a good source of bioactive fragments, nearby 80 proteins overexpressed in human body during viral infections were analyzed by the Kamal software - developed at Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia- in an attempt to find amino acid sequences with physicochemical characteristics similar to those observed in antimicrobial peptides (AMPs). Five peptides (H05, H06, H07, H08 and H09), with possible αhelix structure, were selected to solid phase synthesis and HPLC purification. Theses peptides were subjected to antibacterial and antifungal tests. However, they did not show antimicrobial activity. Then, the prospecting methodology was adapted to search for short IAPs similar to βsheet structures. The peptide found, called Hs10, proved to be a promising alternative, since it has antimicrobial activity, low cytotoxicity and is composed of only 9 amino acid residues. Furthermore, assays of Circular Dichroism (CD), Isothermal Titration Calorimetry (ITC), Light Scattering (DLS) indicated that lipopolysaccharide (LPS) present in the outer membrane of Gramnegative bacteria is closely linked to the mechanism of action of this IAP. Structural studies by CD also suggest that in the presence of anionic biomimetic membranes, Hs10 molecules organize themselves to form an amphipathic structure similar to a β-sheet. Finally, studies carried out using the NMR technique indicate that Hs10 tends to structure itself in the presence of small concentrations of LPS, resulting in a family of convergent structures