Effets du chlorure de guanidinium sur la structure et les propriétés de la caséine- beta en solution et à l'interface avec l'air.

The subject of my work comprises three different part: below a summary: Small angles neutron scattering study:--------------------------------------1-I examined the small-angle neutron scattering profile of beta-casein in the native state and in highly denaturing conditions.It shows that the neutron spectra given by unfolded beta-casein is similar to those of excluded volume polymer chains. Thescattering functions of the semi-flexible chains have been determined with precision. Many approximations have been used infitting of experimental small-angle neutron scattering data from beta-casein in guanidine hydrochloride.The small-angle neutron scattering provides a new tool for investigation of the structure of biological particles. (SANS)data has showed that the denaturation was accompanied by a large decrease of the radius of gyration of beta-casein and itsall completely different from the experimental results of radius of gyration of globular proteins (Phosphoglycerate Kinase).A complementary approach to interpret the SANS data involves the use of analytical polymer theories to describe the chainconfigurational distribution. To our knowledge, very few studies of scattering functions of semi-flexible chains with excludedvolume effects have been done. The only two analytical studies known so far are the one by Sharp and Bloomfield and the otherby Pedersen et. Al. The models for chains with excluded volume fit our experimental data very well, and various results for the structure of thechains have been obtained.2- I still studied the beta-casein micelle in aqueous solution in a wide range of temperatures and denaturant concentrations.I consider that the micelles consisting of a completely uniform inner core formed from the hydrophobic amino acids blocksand uniform outer shell composed of the soluble hydrophilic amino acids blocks. Good agreement with the small angle neutronscattering data on the beta-casein is obtained. The micelles grow in size with increase temperature and the corona are similarto the outer region of mushroom or a brush consisting of end grafted polymer chains.Netron reflectivity and tensiometer study:------------------------------------------Adsorption layers of beta-casein formed from a buffer including various concentrations of guanidine hydrochloride (gdmCl)have been studied by neutron reflectivity. A transition in the structure and in the properties of the adsorption layer seemsto occur around a gdmCl concentration of 1.5 M. These data are interpreted assuming that the adsorbed protein molecules behavelike multi-block copolymers with alternating hydrophilic and hydrophobic sequences. Below the transition the hydrophilic coilsand the hydrophobic two-dimensional blocks have a larger fractal dimension than beyond the transition where they look moreswollen by the " solvent ". The effect of temperature on these effects indicates that they are not dominated by hydrophobicinteractions. Thus the attractions between amino acids which are ruptured by gdmCl might be hydrogen bounds which are frequentlyencountered in the secondary structure of polypeptide chains. These results show that even with the flexible polypeptide chainof beta-casein, interactions between amino acids contribute significantly to the structure of the adsorption layer formedfrom a buffer devoid of denaturing agent.Dans un solvant aqueux, la caséine beta est composée des monomères hydrophiles et hydrophobes et forme des structures micellaires sphériques, dont à partir nous pourrions extraire les caractéristiques principales, exemples la taille et les interactions entre agrégats. Les expériences précédentes ont montré qu'en présence dans la solution d'un agent dénaturant, comme le chlorure de guanidinium (GdmCl), la caséine beta passe d'un état micellaire vers un état de monomère. En présence de 3 et 4M de GdmCl, nous avons remarqué une légère différence entre les valeurs de c/I(0,c) cela traduit par le fait que les solutions de caséine beta ne présentent pas le même contraste. Donc lorsque la concentration du GdmCl augmente le contraste augmente et vise versa. La mesure du second coefficient du viriel nous a permis d'estimer les interactions intermoléculaires lorsque la protéine est dénaturée par une forte concentration de GdmCl. A fortes concentrations de GdmCl les interactions sont répulsives et que les effets de concentrations ne peuvent pas être négligés. Or nous avons remarqué encore que le second coefficients de viriel est très faible et la valeur obtenue ne prouve pas l'aspect d'un état d'une protéine dépliée, mais peut être c'est un état intermédiaire entre un régime où la caséine beta est considérée comme une chaîne gaussiènne et un autre régime où elle est considérée comme une chaîne à volume exclu. La détermination du préfacteur P et de l'exposant alpha permet encore de connaître la nature des interactions. Les valeurs obtenues montrent que la caséine beta en présence de 3M de chlorure de guanidinium se comporte comme un polymère à volume exclu. Donc à partir de ce résultat on peut confirmer l'existence des répulsions à longue distance à l'intérieure de la chaîne polypeptide, interdisent le contact entre les segments d'acides aminés. Nous avons remarqué une contradiction en comparant ce dernier résultat à celui obtenu par l'étude de A2. En fait dans la seconde étude la gamme des q, (3 < qRg < 2 Rg/b) est faible et on ne peut pas confirmer l'état de la protéine si elle est considérée comme une chaîne guaussienne ou à volume exclu. 116 La détermination de L et b met en évidence l'existence de structures résiduelles le long de la chaîne dénaturée. Mais le problème qui se pose, c'est que le modèle de Pedersen et. al n'est pas bien applicable pour la faible zone de q (qb < 3.1). L'effet de concentrations joue un rôle très important. La caséine beta en présence d'une forte concentration de chlorure de guanidinium a un rayon de giration guaussien presque égale au rayon de giration à concentration nulle. Ce résultat prouve que la protéine n'est pas dans état totalement déplié et confirme nos résultats obtenus par l'étude du second coefficient de viriel. 4M de chlorure de guanidinium ne change pas la qualité du solvant. Mais, désormais augmente de façon significative la CMC. Toujours, cette étude prouve que la physique des polymères et l'étude des protéines sont deux aspects complémentaires. Nous avons vu par une approche plutôt simple, une description de la structure des agrégats d'une protéine spécifique. Le modèle de copolymère a pu décrire la caséine beta. Les études expérimentales de la caséine beta, proche d'une interface air / liquide, qui seront présentées plus loin, indiquent également des similitudes avec l'approche théorique..87 L'effet du GdmCl sur l'adsorption de la caséine beta a été étudié par des mesures de la structure et des propriétés de surface des couches formées à l'interface air/tampon. Les mesures de réflectivité des neutrons ont montré que la quantité de protéine adsorbée diminue quand la concentration en GdmCl augmente. Ceci était prévisible du fait que le GdmCl est un agent qui dénature et augmente la solubilité des protéines. Une élévation de la température augmente la concentration de surface totale de la protéine. L'effet hydrophobe semble donc impliqué dans l'énergie d'adsorption. Aux concentrations volumiques élevées de la solution protéique, l'interprétation des résultats laisse à penser qu'une partie de la protéine adsorbée se trouve dans l'air. Ce phénomène a déjà été observé à partir de résultats obtenus par réflectivité des rayons X dans le cas de la caséine beta et par réflectivité des neutrons dans le cas de copolymères multiblocs synthétiques. Il semble donc que l'existence d'une partie de la molécule dans l'air devrait être prise en considération dans tout modèle d'adsorption de copolymères multiblocs à l'interface gaz/liquide. Les propriétés de surface des couches d'adsorption de caséine ont été interprétées à partir du modèle thermodynamique d'un polymère multibloc asymétrique..87 Ainsi, l'effet de la concentration en GdmCl est de changer la conformation des blocs bidimentionnels à partir 117 d'une structure à deux dimensions modérément écroulée vers une structure de chaîne 2 D à volume exclu. Ce changement de structure correspond à la rupture de liaisons non covalentes entre les monomères des blocs bidimentionnels, comme on peut l'attendre des propriétés du GdmCl. Une augmentation de la température semble rompre également des liaisons non covalentes et mène à un gonflement des molécules adsorbées. Ainsi, la conformation des molécules adsorbées dépend fortement d'interactions non covalentes qui ne semblent pas uniquement de nature hydrophobe. Finalement, on peut conclure que de nombreuses liaisons non covalentes contribuent à la structure des blocs solvophobes de la caséine-beta lorsque cette protéine est adsorbée à l'interface tampon/air à partir d'un milieu non dénaturant. La présence d'un concentration suffisante de dénaturant semble rompre ces intéractions et induire des comportements de polymère à volume exclu