Étude de la composition et de l'assemblage du pore de translocation du système de secretion de type III chez Pseudomonas aeruginosa

PSEUDOMONAS AERUGINOSA IS AN OPPORTUNISTIC PATHOGEN FOR HUMANS AND IS ONE OF THE MAJOR AGENTS RESPONSIBLE FOR NOSOCOMIAL INFECTIONS. P. AERUGINOSA, LIKE OTHER GRAM-NEGATIVE PLANT AND ANOMAL PATHOGENS, UTILIZES A TYPE III SECRETION-TRANSLOCATION SYSTEM (TTSS) TO INTOXICATE EUKARYOTIC CELLS. THIS SYSTEM ALLOWS TO THE EXTRACELLULARLY LOCATED BACTERIUM TO INJECT ITS TOXIC PRODUCTS (EFFECTORS) DIRECTLY INTO THE HOST CELL CYTOPLASM. THE SECRETION AND TRANSLOCATION STEPS INVOLVE MORE THAN 20 PROTEINS ASSEMBLED INTO A NEEDLE-LIKE STRUCTURE CALLED INJECTISOMES. COMPONENTS INVOLVED IN EFFECTOR TRANSLOCATION ACROSS THE HOST PLASMA MEMBRANE ARE ENCODED IN THE pcrGVH-popBD OPERON. IN THE LABORATORY, WE HAVE SHOWN THAT THE P. AERUGINOSA CYSTIC FIBROSIS ISOLATE CHA INDUCES TYPE III SECRETION SYSTEM-DEPENDENT ONCOSIS OF PHAGOCYTES. THIS CELLULAR ONCOSIS IS PRECEDED BY THE FORMATION OF PORES INSERTED INTO EUKARYOTICS MEMBRANES. INTERACTION OF P. AERUGINOSA WITH RED BLOOD CELLS (RBC) SHOWED THAT THIS PORES WERE ESTIMATED FROM OSMOPROTECTION EXPERIMENTS TO BE BETWEEN 28 AND 35Å. IN PARALLEL, WE FOUND THAT THERE WAS A SIMULTANEOUS REQUIREMENT FOR ALL THREE PROTEINS, PCRV, POPB, AND POPD, FOR CELL INTOXICATION AND HEMOLYSIS. FRACTIONATION EXPERIMENTS WITH INFECTED RBCs SHOWN THAT ONLY POPB AND POPD FORM THE MEMBRANE-ASSOCIATED CORE OF THE PORE. WE DEMONSTRATED THAT THE ANTI-V ANTIBODIES THROUGH THEIR DIRECT INTERACTION WITH V PROTEINS, INHIBITS BACTERIA-INDUCED HEMOLYSIS, AS IN PCRV MUTANT, BY ACTING AT THE LEVEL OF TYPE III TRANSLOCON ASSEMBLY IN HOST CELL MEMBRANES. THESE RESULTS SUGGESTS THAT PCRV PROTECTIVE ANTIGEN WOULD ACT AS EXTRABACTERIAL CHAPERONES.Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections graves chez les individus immunodéprimés et chez les personnes atteintes de mucoviscidose. Cette pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence, dont l'un, le système de sécrétion de type III (SSTT) est présent chez un grand nombre de bactéries pathogènes à Gram négatif. Ce système de sécrétion permet à la bactérie d'injecter des effecteurs cytotoxiques directement dans le cytoplasme de la cellule eucaryote cible. Chez P. aeruginosa, le SSTT est constitué d'un appareil de sécrétion, appelé Psc (Pop secretion) permettant le passage des effecteurs à travers les membranes bactériennes, et d'un translocon, codé par l'opéron pcrGVHpopBD, permettant l'injection des effecteurs cytotoxiques dans le cytosol de la cellule eucaryote. Nous avons montré dans le laboratoire que l'isolat clinique CHA de P. aeruginosa est capable d'échapper à l'activité bactéricide des polymorphonucléaires neutrophiles humains (PMNs) et d'induire une mort rapide par oncose des phagocytes (Dacheux et al., 2000). Dans un premier volet, l'utilisation des hématies comme modèle cellulaire m'a permis de montrer que cette oncose est précédée par la formation de pores, de taille estimée entre 28 et 35 Å, dans la membrane cytoplasmique de ces cellules. Des expériences de mutagénèse montrent que la formation de ces pores requiert les protéines PcrV, PopB et PopD. L'analyse par Western blot de membranes isolées d'hématies infectées par P. aeruginosa indiquent que les protéines PopB et PopD constituent le pore de translocation inséré dans la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes. La protéine PcrV, qui n'est jamais retrouvée dans la fraction membranaire d'hématies infectées par P. aeruginosa, agit à la surface de la bactérie comme une « chaperonne extracellulaire » responsable de l'assemblage de PopB et PopD en un complexe hétéro-oligomérique. Le second volet traite du mécanisme d'action des anticorps protecteurs anti-PcrV contre les infections à P. aeruginosa. Des expériences de fractionnement d'hématies infectées par P. aeruginosa en présence de ces anticorps protecteurs a permis d'établir que ces derniers inhibent l'assemblage du pore de translocation du SSTT