Mesures parallélisées d'interactions oligosaccharides / protéines au moyen de biopuces

The thesis goal is to design an oligosaccharide chip, compatible with surface plasmon resonance imaging process, where parallel binding events occurring on the top of the surface can be simultaneously monitored and quantified in real time. A model system using heparin as sugar to immobilize has been proposed. The modification of the sugar by a pyrrole group allows to immobilize the oligosaccharide covalently by an electrochemical process. Thus, different molecules containing a pyrrole group and a linker were synthesized. Then the chip was made by successive electrocopolymerizations. The spots can be analyzed by SEM and AFM, before testing the biological recognition between the modified oligosaccharides and the protein. The first experiments using fluorescent labels have allowed to validate the developed system and the suggested chemistry: the presence of negative spots confirm the specificity of the biological interactions detected by fluorescence. Thus, SPR imaging allows to confirm biological interactions sensitivity. Because of the measurements in real time, kinetics of association and dissociation phases can be studied. Following the optimization of the chemistry, this approach was finally applied to the study of different biological problems.Le but de cette thèse est de concevoir une puce à sucres, compatible avec un système optique d'imagerie en résonance des plasmons de surface (SPRi), afin d'analyser simultanément de multiples interactions protéine/oligosaccharide en temps réel. La réalisation d'un système modèle, ayant comme sucre sonde, l'héparine, est proposée. La modification du sucre par un pyrrole permet de le déposer sur une surface d'or par électrocopolymérisation. Cette chimie nécessite la construction de molécules « pyrrole - bras espaceurs » compatibles avec les propriétés des sucres utilisés. La puce utilisable en SPRi est ensuite fabriquée par électrocopolymérisations successives. Ces plots formés peuvent être caractérisés par MEB et par AFM. Des expériences préliminaires utilisant des traceurs fluorescents ont permis de valider le système ainsi que la chimie proposée ; la fluorescence observée est spécifique de l'interaction biologique grâce à la présence de négatifs. Les études d'interactions biologiques suivies par SPRi ont alors été réalisées ; la sensibilité de l'interaction est confirmée. Grâce à l'acquisition en temps réel des interactions, les cinétiques d'association et de dissociation du complexe oligosaccharide/protéine sont observées puis optimisées. De plus, les puces fabriquées sont régénérables mais aussi réutilisables sur plusieurs mois, ce qui permet l'étude des paramètres chimiques et biologiques. Cette approche est appliquée finalement à plusieurs problématiques biologiques