Etude biochimique et fonctionnelle de la protéine PerR de Bacillus subtilis : un senseur bactérien du peroxyde d'hydrogène

The PerR (Peroxyde resistance Regulator) metalloprotein is a transcription factor described as a H2O2 sensor in many micro-organisms. The PerR protein from Bacillus subtilis, isolated in its apo form contains one Zn2+ ion per monomer. Under normal growth conditions, PerR is partially oxidised and inactive in terms of DNA binding. Mass spectrometry and EPR spectroscopy allowed us to connect the metal binding capacity of PerR towards Fe2+ or Mn2+ and its oxidation state. A new expression protocol which leads to a fully reduced form of the protein has been established. It allows the reliable determination of the affinity of the protein for the regulatory metal and the DNA target. The apo-PerR-Zn form has been crystallized and the structure reveals that the Zn2+ ion is part of a structural site. The zinc atom is coordinated in a tetrahedral geometry by the four cysteine residues of the protein (Zn(Cys) 4). This site locks the dimerization domain and increases the dimer stability. The structural role of the zinc site has been confirmed by biochemical experiments which showed a poor reactivity toward H2O2. Fluorescence spectroscopy experiments indicated conformational changes of PerR during manganese incorporation and DNA binding. The formation of the DNA-PerR complex has been studied in more details. Two nucleotides and three amino acids have been shown to be crucial in this interaction. Finally, our work on the oxidized form of PerR showed that the 2-oxo-histidine modified residue is the biological marker of PerR oxidation.La métalloprotéine PerR (Peroxyde resistance Regulator), homodimère de 2 fois 16,5 kDa, est un facteur de la transcription. PerR est le senseur du peroxyde d'hydrogène chez plusieurs microorganismes. PerR de Bacillus subtilis a été isolée sous sa forme apo avec la présence d'un ion Zn2+ par monomère. Dans des conditions de culture non contrôlées, PerR est en partie oxydée de manière aléatoire. La spectrométrie de masse et la spectroscopie RPE nous ont permis de relier la capacité de fixation du métal régulateur (Fe2+ ou Mn2+) et l'oxydation de PerR. Notre travail a permis de mettre au point un protocole d'expression conduisant de manière reproductible à une forme totalement réduite. Ceci a permis la détermination précise de l'affinité de la protéine pour le métal régulateur et l'ADN. La forme apo-PerR-Zn a été cristallisée et cette structure révèle un site structural à zinc avec une coordination tétraédrique par les quatre cystéines de la protéine (motif Zn(Cys)4). Ce site verrouille le domaine de dimérisation, favorisant ainsi la stabilité du dimère. Le rôle structural de ce site a été confirmé par des expériences biochimiques qui mettent en évidence une réactivité faible vis-à-vis d'H2O2. Des études en spectroscopie de fluorescence ont montré des changements conformationnels de PerR en solution après métallation et fixation à l'ADN. La formation du complexe ADN-PerR a été étudiée de manière détaillée et a permis de mettre en évidence deux nucléotides et trois acides aminés essentiels dans cette interaction. Enfin, nos travaux sur la forme oxydée de PerR ont mis en évidence que le résidu 2-oxo-histidine est le marqueur biologique de l'oxydation de PerR