La dynamique structurale de l'acétylcholinestérase: étude réalisée par cristallographie aux rayons X et une méthode spectroscopique complémentaire.

This work aimed at watching acetylcholinesterase (AChE) 'at work'. AChE is a very rapid enzyme and terminates the transmission of the nervous influx at cholinergic synapses. Conformational substates of Torpedo californica (Tc) AChE were trapped in x-ray crystallography structures of the enzyme in complex with putative anti-Alzheimer drugs. Structures of both nonaged and aged conjugates of TcAChE and soman were solved, which allowed to shed light on the mechanism of aging in organophosphate (OP) - inhibited AChE. The structure of the ternary complex of the nonaged conjugate and a reactivator was solved. All those structures will help designing new AChE-targeted drugs (anti-Alzheimer drugs or antidotes against OP poisoning) by taking into account flexibility and minor conformations of the enzyme. The structure of TcAChE in complex with the peripheral site (PAS) inhibitor aflatoxin B1 was solved in two crystal forms. This work revealed crystallography artifacts that should be avoided for correct biological interpretation. Measurement of the phosphorescence lifetime of AB1 allowed probing PAS dynamics on the timescale of seconds, thereby highlighting differential flexibility in two distinct crystal packing environments of TcAChE. This spectroscopic method is proposed as a complementary tool for kinetic crystallography experiments. An optimal cryogenic temperature range was identified, which could help exploring the reaction mechanisms of AChE by slowing down the enzyme motions without freezing them.L'objectif de la thèse était de regarder l'acétylcholinestérase (AChE) en mouvement. L'AChE est une enzyme très rapide qui met fin à la transmission de l'influx nerveux au sein des synapses cholinergiques. À l'aide de la cristallographie aux rayons X, des sous-états conformationnels de l'AChE de Torpedo californica (Tc) ont été piégés par sa liaison à des drogues anti-Alzheimer putatives. Les formes, non vieillie et vieillie, de la TcAChE conjuguée au soman ont été caractérisées structuralement, éclairant ainsi le mécanisme de vieillissement de la TcAChE inhibée par les organophosphorés (OP). La structure du complexe ternaire du conjugué vieilli avec un réactivateur a également été résolue. Toutes ces structures guideront l'élaboration de médicaments (drogues anti-Alzheimer ou antidotes contre l'empoisonnement par des OP) en prenant en compte la flexibilité de l'enzyme et ses conformations minoritaires. La structure du complexe de la TcAChE avec un inhibiteur de son site périphérique (PAS), l'aflatoxine B1 (AB1), a été résolue dans deux formes cristallines. Ce travail a mis en évidence des artefacts de la cristallographie nuisibles à l'interprétation biologique des structures. La mesure du temps de vie de phosphorescence de l'AB1 a permis de sonder les mouvements du PAS à l'échelle de la seconde et de révéler des différences de flexibilité liées à l'empilement cristallin de la TcAChE. Cette méthode spectroscopique est complémentaire à la cristallographie cinétique. La gamme de températures cryogéniques identifiée pourrait en effet faciliter l'exploration du mécanisme réactionnel de l'AChE, en ralentissant l'enzyme sans pour autant la figer