Terapia fotodinâmica no cancro da próstata usando derivados porfirínicos reduzidos

Prostate cancer (PCa) is the second most frequent cancer diagnosed in men worldwide. Among the common treatment options, Photodynamic Therapy (PDT) is being considered a promising local therapy to treat PCa. PDT is an established treatment modality approved for several types of cancer (e.g., bladder, esophageal, and lung cancer), but the low solubility and consequent bioavailability of the currently approved photosensitizers (PS) hampers the wide clinical application of this methodology. In this regard, herein we synthesized several fluorinated porphyrinoid derivatives (porphyrins and reduced derivatives) with suitable photophysical features for PDT of PCa. To prevent the aggregation of some of the prepared molecules and preserve their desirable photophysical properties under the physiological environment, drug delivery systems [liposomes and polyvinylpyrrolidone formulations (PVP)] were prepared to carry the most promising PSs. The best formulation to transport the selected PSs to PCa cells and perform the following in vitro studies was the one involving the PVP formulations (PS1-PVP, PS2-PVP e PS4a-PVP). The in vitro studies were performed towards a PCa cell line (PC-3) and allowed to evaluate the photodynamic efficacy of the synthesized PSs, either in their free form or embedded within PVP. The results demonstrated the negligible dark cytotoxicity of PS1, PS2 and PS4a when these PSs were embedded within PVP (PS1-PVP, PS2-PVP and PS4a-PVP) and confirmed the significant photodynamic effect of PS2-PVP and PS4a-PVP to PC-3 cells, upon red light irradiation (10.6 J/cm2). It is noteworthy that PVP on its own did not presented cytotoxicity in PC-3 cells, as well as the prepared compounds in their free form. To provide insight into the underlying mechanisms of cell death induced by the formulations containing the reduced macrocycles (PS2-PVP- and PS4a-PVP), it was investigated the intracellular localization of each PS in PC-3 cells by confocal microscopy. Since both conjugates were mainly localized in mitochondria, the involvement of this organelle in PS2-PVP-PDT- and PS4a- PVP-PDT-induced apoptosis was further explored. Western blot analysis revealed that the treatment of PC-3 cells with both formulations resulted in the reduction of the expression level of the anti-apoptotic protein Bcl-2. As the photodamage to Bcl-2 following PDT with PS2-PVP and PS4a-PVP was accompanied by further activation of pro-caspase-3, we assumed that upon irradiation the photogenerated reactive oxygen species (ROS) were able to activate a caspase-dependent apoptotic response as a consequence of a postmitochondrial event. Taken together, these findings demonstrated that among the prepared compounds, the reduced derivatives, PS2-PVP and, especially, PS4a-PVP, were significantly more effective in overall PC-3 cell killing than the other tested derivatives, thus highlighting their great potential as therapeutic agents for PCa.O cancro de próstata (PCa) é a segunda principal causa de morte por cancro na população masculina. Entre as opções de tratamento mais comuns, a terapia fotodinâmica (PDT) é considerada uma terapia promissora para este tipo de cancro. A PDT é uma modalidade terapêutica já aprovada para alguns tipos de cancro (ex. bexiga, esófago e pulmão), contudo, a baixa solubilidade e a consequente biodisponibilidade dos fotossensibilizadores (PS) aprovados, dificulta a sua ampla aplicação clínica. Por esse motivo, neste trabalho prepararam-se vários derivados porfirínicos (porfirinas e os análogos reduzidos) com características fotofísicas promissoras para serem aplicados na PDT do PCa. De forma a prevenir a agregação dos derivados quando em condições fisiológicas e preservar as suas propriedades fotofísicas, foram preparados nanosistemas [lipossomas e formulações de polivinilpirrolidona (PVP)] para a veiculação dos derivados mais promissores. O melhor sistema para transportar os PSs selecionados até às células de PCa e seguir para estudos in vitro foi o que envolveu PVP (PS1-PVP, PS2-PVP e PS4a-PVP). Os estudos in vitro foram realizados numa linha celular de PCa (PC-3) e permitiram avaliar a eficácia fotodinâmica dos PSs preparados, quer na sua forma livre quer formulados em PVP. Esses estudos demonstraram que os PSs PS1, PS2 e PS4a, quando formulados com PVP (PS1-PVP, PS2-PVP e PS4a-PVP), não apresentaram citotoxicidade no escuro, e confirmaram um efeito fotodinâmico significativo do PS2 e PS4a nas células PC-3, após irradiação com luz vermelha (10,6 J.cm-2). É importante referir que o PVP só por sim, bem como os derivados não formulados, não mostraram qualquer atividade fotodinâmica contra as células PC-3. De forma a melhor compreender os mecanismos subjacentes à morte celular induzida pela PDT com as formulações PS2-PVP e PS4a-PVP, foi investigada por microscopia confocal a localização intracelular de cada PS nas células PC-3. Uma vez que ambos os conjugados se localizaram maioritariamente nas mitocôndrias das células, o envolvimento deste organelo na apoptose induzida pelo tratamento das células com ambos os conjugados, foi explorado posteriormente. A análise por Western blot revelou que o tratamento das células PC-3 com ambas as formulações resultou na redução do nível de expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2. Como o dano nesta proteína foi acompanhado pela ativação da pro-caspase-3, presumimos que após irradiação com luz vermelha, as espécies reativas de oxigénio (ROS) produzidas foram capazes de induzir apoptose por uma via dependente de caspases. Em suma, os resultados obtidos demonstraram que, entre os compostos preparados, os derivados reduzidos, PS2-PVP e, em especial, PS4a-PVP, foram significativamente os mais eficazes na indução de morte celular, destacando assim seu grande potencial como agentes terapêuticos para o PCa.Programa Doutoral em Bioquímic