3D Live-cell Imaging of In Vitro Neuronal Microtissues - Using Spectral Image Scanning Microscopy

Les modèles cellulaires tridimensionnels se sont avérés plus pertinents sur le planphysiologique que les plaques de culture bidimensionnelles. Plus précisément, pourimiter les connexions et les activités synaptiques de type in vivo, un modèle expérimentalrécemment développé, connu sous le nom de sphéroïdes - des agrégations decellules en 3D - a été utilisé pour étudier les réseaux neuronaux[1] [2]. Cependant, lesmodèles existants sont de grande taille (>100 μm) et ne se prêtent pas à l’imagerie3D de cellules vivantes à la résolution d’une cellule unique en raison de la limite dediffraction et de pénétration de la lumière.Nous avons ici combiné un modèle 3D invitro pour étudier les contacts synaptiques avec une technique d’imagerie qui permetde suivre les événements dynamiques au niveau synaptique avec une haute résolutionspatio-temporelle et spectrale. Dans ce travail, les sphéroïdes neuronaux sontformés dans des modèles d’hydrogel de taille et de forme standardisées. Ces modèlesà base d’hydrogel sont fabriqués à l’aide d’un système de projecteur UV à motifs,d’un macromonomère et d’un photoinitiateur par un processus de polymérisationradicalaire. Le résultat est un substrat dont la rigidité est proche des conditionsphysiologiques et qui permet l’auto-agrégation des neurones. Les sphéroïdes formésdans ces gabarits ont montré une organisation et des caractéristiques biochimiquessimilaires à celles rapportées précédemment. Les neurones dans les sphéroïdes ontété transfectés de manière sélective et éparse avec des rapporteurs fluorescents. Pourréaliser l’imagerie 3D en direct du modèle, nous avons mis au point une nouvelle techniquede microscopie à balayage d’images spectrales avec des capacités de sectionnementoptique et de résolution spectrale. Un dispositif numérique à micro-miroirsgénère des éclairages ponctuels qui permettent de réaliser des coupes optiques àl’aide d’un algorithme de discrimination. Pour générer des images multicolores, unprisme est utilisé pour disperser la lumière d’émission le long de son axe et collectéepar une caméra CMOS rapide. Par colocalisation, sommation et filtrage spatial, lebalayage spectral de l’image génère une image avec une résolution spatiale de 350nm latéralement et 450 nm axialement. L’imagerie prolongée (20 heures) de neuronestransfectés avec la GFP et le tdtomato met en évidence la capacité de l’ISMspectral pour l’imagerie 3D de cellules vivantes. La combinaison d’un ISM Spectralbasé sur la DMD et de modèles d’hydrogel présente un grand potentiel pour desétudes plus poussées des cellules du cerveau humain au niveau des synapses dansun environnement 3D utilisant des cellules souches pluripotentes induites.To better understand complex brain interconnections, 3-dimensional cell modelshave proven to be more physiologically relevant than 2-dimensional culture plates.Specifically, to mimic in vivo-like synaptic connections and activities, a recently developedexperimental model known as spheroids - 3D cell aggregations - have beenused to study neuronal networks[1] [2]. However, existing models are large (>100μm) and not amenable for live-cell 3D imaging at the single-cell resolution due tothe diffraction and penetration limit of light. Here we combined a 3D in vitro modelto investigate synaptic contacts with an imaging technique that allows monitoringdynamic events at synaptic level with high spatio-temporal and spectral resolution.In this work, neuronal spheroids are formed in hydrogel templates with standardizedsizes and shapes. These hydrogel-based templates are fabricated by a patterned UVprojector system, a macromonomer, and a photoinitiator through a radical polymerizationprocess. The result is a substrate with stiffness close to physiologicalconditions that enable the self-aggregation of neurons. Spheroids formed in thesetemplates showed similar organization and biochemical characteristics to those previouslyreported. Neurons in the spheroids were selectively and sparsely transfectedwith fluorescent reporters. To perform live-cell 3D imaging of the model, we developeda novel spectral image scanning microscopy technique with optical sectioningand spectral resolution capabilities. A digital micro-mirror device generates pointilluminations which allow optical sectioning using a discrimination algorithm. Togenerate multicolor images, a prism is employed to disperse emission light along itsaxis and collected by a fast CMOS camera. By colocalizing, summing, and spatialfiltering, spectral image scanning generates an image with a spatial resolution of350 laterally nm and 450 nm axially. Extended time-lapse imaging (20 hours) ofneurons transfected with GFP and tdtomato highlights the ability of the SpectralISM for 3D live-cell imaging. The combination of a DMD-based Spectral ISM withhydrogel templates shows great potential for further investigations of human braincells at the level of synapses in a 3D environment using induced pluripotent stemcells