Changes in gene expression levels of tight junction proteins following PPARγ activation in hypertensive rat

Hipertansiyon tüm dünyada ve ülkemizde çok sık karşılaşılan bir sağlık sorunudur. Hipertansif süreçte kan beyin engelinin önemli bileşenleri olan sıkı bağlantı proteinlerinde ve bunların adaptör proteinlerinde azalma dikkat çekicidir. Söz konusu proteinlerin miktarını arttıracak ve dolayısıyla kan beyin engelinin fizyolojik olarak bütünlüğünü korunmasına katkıda bulunacak terapötik stratejiler hipertansiyona bağlı gelişen beyin hasarının önüne geçebilecektir. Peroksizom proliferatör-aktive reseptörler (PPAR) ligand bağımlı transkripsiyon faktörleridir ve PPARγ’nın sıkı bağlantı proteinlerini etkilediği bilinmektedir. PPARγ aktivasyonunun hipertansif süreçte beyin sapında sıkı bağlantı proteinlerini nasıl etkilediğini gösteren sistemli ve detaylı bir çalışma henüz yapılmamıştır. Tezin amacı; hipertansiyonla ilişkili beyin bölgesi olan beyin sapında PPARγ aktivasyonuyla ilişkili sıkı bağlantı proteinlerini transkripsiyonel düzeyde araştırmak ve beraberinde inflamasyonla (tümör nekroz faktörüα (TNFα) ve interlökin-1β (IL-1β)) ve apoptozla (kesilmiş kaspaz-3, kesilmiş kaspaz-9, poli (ADP-riboz) polimeraz-1 (PARP-1)) ilişkilendirilen birtakım proteinlerdeki değişimini incelemektir. Çalışmada spontan hipertansif sıçanlar (SHR) (n=6), PPARγ agonisti (pioglitazon) uygulanmış SHR sıçanlar (n=6), borderline hipertansif sıçanlar (BHR) (n=6) ve PPARγ agonisti (pioglitazon) uygulanmış BHR sıçanlar (n=6) olmak üzere 4 grup yer almaktadır. Sıkı bağlantı proteinlerine (occludin, claudin-1, claudin-2, claudin-12, ZO-1) ait mRNA düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (real-time PCR) tekniği kullanılarak sıçanların beyin sapında ölçülmüştür. Ayrıca uygulamanın nöroinflamatuar süreçlere etkisi IL-1β ve TNFα aracılığıyla ELISA yöntemi; apoptotik süreçlere etkisi kesilmiş kaspaz-3, kaspaz-9 ve PARP-1 aracılığıyla Western Blot yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Pioglitazon uygulanmış SHR’lerin beyin sapında TNFα (p=0,0400) ve IL-1β (p=0,0013) değerleri SHR grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur. Diğer taraftan, BHR’lerde TNFα ve IL-1β düzeyleri pioglitazon tedavisinden SHR’ye göre daha az etkilenmiştir. SHR ile karşılaştırıldığında; BHR beyin sapında occludin, claudin-2 ve claudin-12 mRNA düzeyleri sırasıyla 1,38 (p>0,05), 7,50 (p=0,0005) ve 1,73 (p>0.05) kat yüksek bulunmakla birlikte pioglitazonun SHR’de daha etkili olduğu tespit edilmiştir. SHR gruplarında pioglitazon; occludin (8,27 kat, p=0,0013), claudin-2 (3,16 kat, p=0,0011) ve claudin-12 (1,89 kat, p=0,049) mRNA düzeylerini arttırırken proinflamatuar ve apoptoz belirteçlerini istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaltmıştır (p˂0,05). Tez kapsamında (i) hipertansiyonda PPARγ aktivasyonunun sıkı bağlantı proteinleri ve beraberinde inflamasyon ve apoptoz üzerine etkisi araştırılmış, (ii) farklı deneysel hipertansiyon modellerinde (spontan ve borderline) söz konusu parametrelerdeki yanıt karşılaştırılmıştır. Çalışmamız, PPARγ aktivasyonunu takiben beyin sapında sıkı bağlantı proteinlerinin gen ekspresyonunda ve apoptotik parametrelerdeki değişikliklerin esansiyel hipertansiyonda nöral korumaya katkıda bulunabileceği sonucuna varmamızı sağlamıştır.Hypertension is a common health problem in the world and in our country. The decrease in tight junction proteins and their adapter proteins, which are important components of the blood brain barrier, in the hypertensive process is remarkable. Therapeutic strategies that will increase the amount of these proteins and thus contribute to maintaining the physiological integrity of the blood-brain barrier can prevent brain damage due to hypertension. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are ligand-dependent transcription factors and are known to affect tight junction proteins. No systematic and detailed study has yet been conducted to show how PPARγ activation affects tight junction proteins in the brainstem during hypertension. The purposes of the current thesis are to investigate the tight junction proteins associated with PPARγ activation at the transcriptional level in the brain region associated with hypertension and to examine the changes in inflammatory proteins such as TNFα and IL-1β and apoptotic parameters such as cleaved caspase-3, caspase-9 and PARP-1. Animals were divided into four groups namely spontaneous hypertensive rats (SHR) (n=6), PPARγ agonist (pioglitazone) treated SHRs (n=6), borderline hypertensive rats (BHR) (n=6) and PPARγ agonist (pioglitazone) treated BHRs (n=6). The mRNA levels of tight junction proteins (occludin, claudin-1, claudin-2, claudin-12, ZO-1) were measured in the brainstem using real-time PCR technique. In addition, the effect of the treatments on neuroinflammation and apoptosis was evaluated using the ELISA method and Western Blot, respectively. The levels of TNFα (p=0.0400) and IL-1β (p=0.0013) in brainstem of pioglitazone-treated SHRs were significantly decreased. Interestingly, pioglitazone treatment altered TNFα and IL-1β levels in BHR less than expected. Results from this study confirm higher occludin, claudin-2 and claudin-12 mRNA expressions in brainstem of BHRs than SHRs (1.38-fold, 7.50-fold and 1.18-fold, respectively). On the other hand, pioglitazone was found more effective in terms of regulating gene expression in SHR group. Pioglitazone significantly increased mRNA levels of occludin (8.27-fold), claudin-2 (3.16-fold) and claudin-12 (1.89-fold) accompanied with decreased proinflammatory factor levels and apoptotic protein levels in SHR group (p˂0.05). Within the scope of this thesis (i) the effect of PPARγ activation on tight junction proteins in hypertension was investigated, (ii) the response in these parameters in different experimental models of hypertension (spontaneous and borderline) was compared. Our work has led us to conclude that alterations in the gene expression of tight junction proteins and apoptosis parameters in the brainstem following PPARγ activation may contribute to neuroprotection in essential hypertension