Investigation of the protective effect of Boldine against rotenone toxicity in SH-SY5Y cells

İnsan ömrünün uzamasıyla paralel olarak nörodejeneratif hastalıkların görülme sıklığı artmıştır. Dünya’da 50 milyon kişinin nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip olduğu ve 2050 yılına kadar bu rakamın 115 milyon kişiye çıkacağı tahmin edilmektedir. Bu hastalıklardan biri olan Parkinson hastalığı Dünya genelinde 10 milyondan fazla kişiyi etkileyen, Alzheimer hastalığından sonra ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır. Beyinde substansiya nigra bölgesinde bulunan dopaminerjik nöronların hasarı ve kaybı sonucu, striatumda dopamin eksikliği ile birlikte gelişen, tremor, bradikinezi, rijidite ve postural instabilite ile seyreden kronik ve ilerleyici bir hastalıktır. Hastalığın etiyopatogenezi tam olarak çözülememiş olsa da literatürdeki çalışmalar, yaşlanma, genetik faktörler, gibi etkenlere ve pestisitler, ağır metaller gibi çevresel toksinlerin yarattığı nörotoksisiteye işaret etmektedir. Mevcut veriler, PH'nin önlenmesinin veya erken tedavisinin en etkili terapötik strateji olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle hastalığın etyopatogenezini aydınlatmak ve yeni tedavi stratejileri geliştirmek amacıyla in vivo ve in vitro deneysel Parkinson modelleri oluşturulmaktadır. Bu modellerden biri de rotenon toksisitesi modelidir. Rotenon sıklıkla hayvan ve hücre çalışmalarında deneysel Parkinson modeli oluşturmak için kullanılmakta olan organik bir pestisittir. Mitokondrideki elektron taşıma sistemi Kompleks 1 inhibisyonu yoluyla oksidatif stresi arttırır. Hücre ve hayvanlarda Parkinson hastalığı benzeri etkiler oluşturur. Bu tez çalışmasında insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y hücrelerinde in vitro Parkinson modeli oluşturmak için organik bir pestisit olan rotenon ile toksisite oluşturulmuştur. Flavonoidler, E ve C vitaminleri gibi çeşitli antioksidanların Parkinson hastalığına ve rotenon toksisitesine karşı koruyucu olduğu literatürde bildirilmiştir. Çalışmamızda Latin Amerika geleneksel tıbbında karaciğer ve sindirim sistemi bozukluklarının tedavisinde kullanılan bir alkaloit olan ve güçlü antioksidan ve antiinflamatuar etkileri olduğu bildirilen boldin'in nöroprotektif etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada rotenonun öldürücü dozunu (LD50) bulmak için SH-SY5Y hücrelerine 24 saat boyunca artan dozlarda rotenon uygulanmıştır. MTS testi ile, 24 saat boyunca 200 nM rotenona maruz bırakılan gruptaki hücre sayısının, tedavi edilmeyen kontrol grubuna göre yaklaşık yarısı kadar azaldığı belirlenmiştir. Boldin'in koruyucu etkinliğini belirlemek için SH-SY5Y hücre gruplarına 2 saat boyunca çeşitli dozlarda boldin ön tedavisi uygulanmış ve boldin ön muamelesinden sonra 24 saat boyunca 200 nM rotenona maruz kalan gruplarda hücre sağkalımı MTS testi ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin koloni oluşturma kapasitesini değerlendirmek için klonojenik test uygulanmıştır. Apototik hücre ölümünü saptamak için ELİSA yöntemi ile aktif kaspaz 3 düzeyleri belirlenmiştir ve hoechst boyama yapılmıştır. Çalışmamızın sonucunda elde edilen bulgular rotenonun SH-SY5Y hücrelerinde nörotoksik olduğunu ve apoptotik hücre ölümünü indüklediğini göstermiştir. Test sonuçları, düşük dozlarda boldin'in rotenon kaynaklı toksisiteye karşı hücre sağkalımını artırarak nöroprotektif bir etkiye sahip olduğunu ve bu artışın boldin'in antiapoptotik aktivitesinden kaynaklanabileceğini ortaya koymuştur. Ek olarak, düşük dozlarda boldin'in hücre çoğalmasını ve koloni oluşturma potansiyelini de desteklediğini göstermiştir.In parallel with the prolongation of human life, the incidence of neurodegenerative diseases has increased. It is estimated that 50 million people in the world suffer from neurodegenerative diseases and this figure will increase to 115 million people by 2050. Parkinson's disease, one of these diseases, is the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer's disease, affecting more than 10 million people worldwide. It is a chronic and progressive disease that develops with dopamine deficiency in the striatum as a result of damage and loss of dopaminergic neurons located in the substantia nigra region of the brain, and progresses with tremor, bradykinesia, rigidity and postural instability. Although the etiopathogenesis of the disease has not been fully resolved, studies in the literature point to factors such as aging, genetic factors, and neurotoxicity caused by environmental toxins such as pesticides and heavy metals. The current data suggest that prevention or early treatment of PD may be the most effective therapeutic strategy. Therefore, in vivo and in vitro experimental Parkinson's models are created to elucidate the etiopathogenesis of the disease and to develop new treatment strategies. One of these models is the rotenone toxicity model. Rotenone is an organic pesticide that is often used to establish an experimental Parkinson's model in animal and cell studies. The electron transport system in mitochondria increases oxidative stress through Complex 1 inhibition. It produces Parkinson's disease-like effects in cell and animal studies. In this thesis study, toxicity was created with rotenone, an organic pesticide, in order to create an in vitro Parkinson model in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y cells. It has been reported in the literature that various antioxidants such as flavonoids, vitamins E and C are protective against Parkinson's disease and rotenone toxicity. In our study, we aimed to investigate the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid used to treat liver and digestive system disorders in Latin American traditional medicine, which has reported strong antioxidant and anti-inflammatory effects. In the study, increasing doses of rotenone were applied to SH-SY5Y cells for 24 hours to find the lethal dose (LD50) of rotenone. It was determined by the MTS assay that in the group exposed to 200 nM rotenone for 24 hours the cell count was reduced by approximately half that of the untreated controls. In order to determine the protective efficacy of boldine, various doses of boldine pretreatment were applied to SH-SY5Y cell groups for 2 hours. Cell survival in groups exposed to 200 nM rotenone for 24 h after boldine pretreatment was assessed by the MTS assay. The clonogenic assay was applied to evaluate the colony forming capacity of the cells. Hoechst staining was performed to detect apoptotic cell death and active caspase 3 was evaluated by ELISA assay. The findings obtained as a result of our study showed that rotenone is neurotoxic in SH-SY5Y cells and induces apoptotic cell death. The test results revealed that low doses of boldine have a neuroprotective effect by increasing cell survival against rotenone-induced toxicity, and this increase may be due to the antiapoptotic activity of boldine. In addition, it showed that low doses of boldine also promoted cell proliferation and colony formation potential