Meme kanserine karşı HER2/Neu antijeni ve Saponin adjuvanı içeren aşı kombinasyonunun geliştirilmesi

Günümüz meme kanser vakalarının %20’sini HER2 pozitif meme kanseri oluşturmaktadır. Normal hücrelerde epitel büyüme faktör reseptörü görevi olan HER2, kanser hücrelerinde overeksprese Olmakta ve kanseri oldukça agresif bir foruma dönüşmektedir. Günümüz kanser tedavi yöntemleri hasta vücudunda birçok yan etkiyi de beraberinde getirmektedir. Bu nedenden dolayı, güncel kanser tedavi araştırma çalışmaları immünoterapötik yöntemlere yönelmiştir. İmmünoterapi, kısaca vücudun bağışıklık sistemini kullanarak kanser hücrelerine karşı tetikleme yöntemi olarak bilinmektedir. Yürütülen tez çalışmasında, yeni bir kombinasyon immünoterapi modeli olarak HER2/Neu antijeni yüklenen dendritik hücre bazlı aşı ile saponin adjuvanını (QS-21) birlikte kullanarak bir kombinasyon immünoterapi modeli geliştirilmeye çalışılmıştır. Çalışmada anti-PD-L1 monoklonal antikoru ve kemoterapötik ajan olan doksorubisin içeren farklı formülasyonlar da çalışmaya dahil edilmiştir. Bu aşı sayesinde hem bağışıklık hücrelerinin tümöre karşı tetiklenmesi, hemde tümör hücrelerinin immün sistemden evazyonunun engellenmesi hedeflenmiştir. Yürütülen tez çalışması 2 ana deney seti kurularak gerçekleştirilmiştir. Kurulan ilk deney setinde, aktif immünoterapi ile pasif immünoterapi birlikte kullanılmıştır. İlk deney setinde 1.5 x 10⁶ hücre/ml HER2 pozitif 4T1 hücreleri 6-8 haftalık farelere çalışmanın 0. gününde xenograft model oluşturulmuş ve aşılama prosedürü 1. gün başlayıp; haftada 1 kere toplam 2 hafta boyunca uygulanmıştır. Çalışmada anti-PD-L1 monoklonal antikoru ise 4. ve 9. günlerde farelere uygulanmıştır. İkinci deney setinde ise aktif ve pasif immünoterapi yaklaşımlarına ek olarak kemoterapötik bir ajan olan doksorubisin de eklenmiştir. İkinci deney setinde ise 5 x 10⁶ hücre/ml HER2 pozitif 4T1 hücreleri 6-8 haftalık farelere çalışmanın 0. gününde enjekte edilmiş, ve aşılama prosedürü 4. gün başlayıp; haftada 1 kere toplam 2 hafta boyunca uygulanmıştır. Çalışmada anti-PD-L1 monoklonal antikoru ise 4. ve 9. günlerde farelere uygulanmıştır. Doksorubisin ise, çalışmanın 5. ve 10. günlerinde farelere uygulanmıştır. Çalışma sonunda sakrifiye edilen farelerin ağırlıkları ve tümör boyut ölçümü yapıldıktan sonra tümör, dalak dokuları ve kan örnekleri toplanmıştır. Kullanılan aşı kombinasyon etkinliğini belirlemek amacı ile, LDH assay, flow sitometri ile CD8+ T hücre, ELISA ile HER2 spesifik antikor (IgG, IgG1, IgG2a) tayini ve immünohistokimya (CD4+, CD8+,CD61+) çalışmaları yürütülmüştür. Çalışmada farklı aşı kombinasyonu denenmiş ve elde edilen bulgularda etkili aşı kombinasyonlarının tümör hacimlerinde anlamlı küçülmeler gözlemlenmiştir. İlk çalışmada DH+HER2/Neu+QS-21+anti-PD-L1 kombinasyonu en etkili kombinasyon olarak öne çıkmış ve LDH spesifik sitotoksite çalışmasında %35-40 hücre ölümüne neden olmuştur. Uygulanan ayni formülasyona ait fare grubundan alınan kan serum örneklerinde anti-HER2 antikor titresi anlamlı düzeyde yüksek çıkmış, ve bu gruba ait total CD8+ T hücre popülasyonu ile IFN-γ salgılayan CD8+ T hücre popülasyonunda kontrol ile diğer aşı gruplarına göre anlamlı farklar elde edilmiştir. Bunun yanı sıra CD4+, CD8+ ve CD61+ hücre popülasyonlarının incelendiği immünohistokimya çalışmaları ile elde edilen bulgular birbiriyle parallel olmaktadır. En etkili formülasyon olarak bulunan gruba ait tümör kesitlerinde immün hücre popülasyonunda diğer gruplara göre artış olduğu gözlemlenmiştir. Yürütülen 2. çalışmada ise en etkili kombinasyon Doksorubisin+DH+HER2/Neu+QS-21+anti-PD-L1 kombinasyonu olarak öne çıkmış ve LDH spesifik sitotoksite çalışmasında %45-50 hücre ölümüne neden olmuştur, Uygulanan ayni formülasyona ait fare grubundan alınan kan serum örneklerinde anti-HER2 antikor titresi anlamlı bir şekilde yüksek çıkmış, ve bu gruba ait total CD8+ T hücre popülasyonu ile IFN-γ salgılayan CD8+ T hücre popülasyonunda anlamlı farklar elde edilmiştir. Bunun yanı sıra CD4+, CD8+ ve CD61+ hücre popülasyonlarının bakıldığı immünohistokimya çalışmaları ile elde edilen bulgular birbirine parallel olmaktadır. En etkili formülasyon olarak bulunan gruba ait tümör kesitlerinde immün hücre popülasyonunda diğer gruplara göre artış olduğu gözlemlenmiştir. Kullanılan immün kontrol noktası inhibisyonuna neden olan mAb’ı ile aşı etkinliğinin arttığı gözlemlenmiş ve kullanılan aktif immünoterapi ajanı olan dendrtik hücrenin etkinliğini de arttırdığı belirlenmiştir. Kemoterapi ile birlikte kullanıldığında ise immünotterapötik kombinasyonun etkisi daha da artmıştır. Bu tez çalışması ile ilk kez meme kanserine karşı oluşturulan bir modelde aktif, pasif immünoterapi ve kemoterapi içeren 3’lü kombinasyon terapi modeli uygulanmıştır. Bu yönüyle bir ilk olan bu çalışmanın kanser tedavi yaklaşımlarına katkı sağlayarak alternatif bir yaklaşımları ortaya koymuştur.HER2 positive breast cancer cases covers more than %20 of total breast cancer cases in the World. HER2, functions as an epithelial growth factor receptor on normal cells, gets abruptively overexpressed n cancerous cells making it very aggressive phenotype. Current cancer therapeutics are not powerful enough to destroy this tremendous disease. Apart from not curing totally, they also have many side effects. Because of all that reason, current cancer research studies were directed towards immunotherapeutics. Immunotherapy is basically using hosts immune system to fight with cancer cells. In this thesis, a novel combination immunotherapy composed of HER2/Neu based vaccination together with saponin adjuvant (QS-21) was investigated against HER2 positive breast cancer. For this purpose, various combinations including dendritic cells loaded with HER2/Neu antigen, addition of anti-PD-L1 mAb and usage of chemotherapeutic agent doxorubicin was added to the combination groups to further support the vaccine formulation. The combination immunotherapy formulated in this thesis project was aiming to boost host immune response against tumor cells as well as blocking immune evasion of the target tumor cells. Two main experiments were set up in this study. In the first study, the effect of active and passive immunotheraoy combination was investigated on 6-8 weeks old Balb/c mice that was subcutaneously injected 1.5 x 10⁶ cells/ml HER2 expressing 4T1 cells were used on day 0 to form a xenograft model of breast cancer. Vaccination protocol was started at day 1, and mice were injected two times total once in a week. Anti-PD-L1 mAb was given to the mice on days 4 and 9. In the second experimental set up, active and passive immunizations were further supported by doxorubicin. The effect of triple combination immunotherapy was investigated on 6-8 weeks old Balb/c mice that was subcutaneously injected 5 x 10⁶ cells/ml HER2 expressing 4T1 cells on day 0 of the experiment. Vaccination protocol was started at day 1, and mice were injected once in a week, two times. Anti-PD-L1 mAb was given to the mice on days 4 and 9. Doxorubicin was given to the mice at 5mg/ml concentration at days 5 and 10. At the end of the study, tumor dimensions were measured and mice were sacrificed to collect serum, spleen tissues, and tumors for further evaluation of the vaccine efficiency. LDH assay, Flow cytometric measurement of CD8, CD3 and IFN-γ levels, ELISA for determining the antibody titer and IHC studies were performed for analyzing the immune response rates in different combinations. In the first study, DC+HER2/Neu+QS-21+anti-PD-L1 combination group demonstrated the best effect in terms of both tumor dimensions, tumor specific cytotoxicity with 35-40% cell lysis, anti-HER2 antibody titer as well as highest stimulation of CD8+ T cells and IFN- γ secretion. IHC data further supported the local and internal populations of CD4+ and CD8+ T cells in the tumor niche. It also demonstrated that, DC+HER2/Neu+QS-21+anti-PD-L1 vaccine combination showed the least metastatic and tumorigenic potential among other vaccine formulations. In the second study, Doxsorubisin+DC+HER2/Neu+QS-21+anti-PDL1 combination group demonstrated the best effect in terms of both tumor dimensions, tumor specific cytotoxicity with 45-50% cell lysis, anti-HER2 antibody titer as well as highest stimulation of CD8+ T cells and IFN-γ secretion. IHC data further supported the local and internal populations of CD4+ and CD8+ T cells in the tumor niche. It also demonstrated that, DC+HER2/Neu+QS-21+anti-PD-L1 vaccine combination showed the least tumorigenic potential among other vaccine formulations. In this study, active and passive immunotherapeutics were used for the first time together with a chemotherapeutic agent. The results obtained from the study are very promising and we believe that this study would highlight the importance of combination immunotherapies especially the triple combination groups against cancer