Two-volume fluorescence correlation spectroscopy for in-situ studies of cell signaling events

L'architecture et la dynamique des molécules formant la membrane cellulaire sont des éléments-clés de la compréhension des mécanismes qui gouvernent l'activité cellulaire. Des résultats récents dans notre équipe [1] ont montré que la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) était une approche pertinente dans ce contexte. Elle a permis notamment de quantifier in-vivo des structures membranaires [2], mesure inaccessible en microscopie conventionnelle. Nous proposons d'étendre cette technique à l'étude spatio-temporelle de la cellule au cours d'un évènement de signalisation. Dans un tel état transitoire, il est raisonnable de penser que la perturbation apportée ne sera pas distribuée uniformément sur l'ensemble de la cellule mais localisée initialement aux régions activées, pour ensuite cheminer progressivement vers le noyau. Aussi, afin de garantir la meilleure description tant spatiale que temporelle, la nouvelle expérience que nous développons utilise deux points de mesure indépendants pouvant être positionnés arbitrairement par l'expérimentateur dans la cellule à étudier. Ces deux points peuvent être utilisés soit pour mener deux mesures distantes simultanées, soit pour étudier les corrélations temporelles entre régions cellulaires voisines. Nous présentons une série complète de procédures permettant de mesurer en temps réel les positions relatives de ces deux points, paramètre clé de notre méthode. Dans, le plan, une méthode d'imagerie réciproque permet de mesurer les positions avec une précision de l'ordre de 50 nm. En profondeur, une procédure automatique de balayage longitudinal permet, à même l'échantillon, de mesurer des différences de profondeur à 500 nm près. En définitive, l'espace total accessible par les deux points de mesure, couvre plusieurs dizaines de microns dans le plan et une dizaine de microns en profondeur. Sur ces dimensions compatibles avec les échelles cellulaires, des mesures de FCS en solution ont confirmé la bonne homogénéité des conditions de mesure (volume confocal et taux de comptage par molécule). Différents modes de balayages sont en outre possibles pour chaque point de mesure, permettant de compléter les mesures ponctuelles par l'acquisition d'images ou de signaux mesurés sur des trajectoires arbitraires. Actuellement équipée d'un laser continu, l'expérience accueillera prochainement un laser impulsionnel Sa :Ti accordable, qui permettra, par excitation à deux photons, d'étendre la gamme de marqueurs fluorescents accessibles, et donnera accès à des nouveaux types de contrastes non-linéaires, comme la génération de second harmonique