Biotechnological strategies to induce resistance to sharka in p. persica l.

I virus delle piante rappresentano una sfida per l’agricoltura. Fin dalla sua scoperta all’inizio degli anni Novanta, il meccanismo dell’RNA interference (RNAi) è stato utilizzato come strumento per indurre resistenza a virus in molte specie vegetali. In questa tesi, sono stati riassunti gli aspetti più importanti dell’Host-induced gene silencing (HIGS) come possibile strategia di difesa contro i virus in pianta. In particolare, sono stati descritti i costrutti genici basati sull’RNAi, che vengono utilizzati per indurre nella pianta ospite una resistenza stabile contro i virus, attraverso il post-transcriptional gene silencing (PTGS). Recentemente, come strumento alternativo all’integrazione stabile di costrutti genici RNAi nel genoma della cellula vegetale, è stata esplorata una nuova strategia nota come Spray-induced gene silencing (SIGS), che consiste nell’applicazione di piccole molecole di RNA (sRNAs) direttamente sulla pianta. Nello specifico, la Sharka rappresenta un danno enorme per la produzione di pesche a livello mondiale e il suo agente eziologico, il plum pox virus (PPV), è incluso nella Top 10 dei virus vegetali più catastrofici. Con il fine ultimo di sviluppare strategie per indurre resistenza al PPV in pesco sfruttando l’RNAi, in questa tesi sono stati tentati entrambi gli approcci HIGS e SIGS. In particolare, con lo scopo di esprimere stabilmente in pesco molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) che inducono il meccanismo dell’RNAi contro il PPV (strategia HIGS), questo lavoro si è focalizzato sullo sviluppo di protocolli in vitro di rigenerazione e trasformazione genetica adatti per questa specie. I risultati ottenuti dimostrano che le varie strategie adottate per la rigenerazione di germogli avventizi in P. persica L. sono efficaci. Anche se con efficienze diverse, la rigenerazione via organogenesi è stata ottenuta a partire da tessuti maturi e giovani di vari genotipi di pesco. Diversamente, l’integrazione del transgene/i nel genoma della pianta usando specie diverse di Agrobacterium e il conseguente ottenimento di piante trasformate è estremamente difficile. In tempi recenti, l’applicazione esogena di RNAi-dsRNA in pianta (strategia SIGS) è considerata un approccio di difesa promettente contro i virus per quelle specie (come il pesco) recalcitranti alla trasformazione genetica. Con l’obiettivo di sviluppare prodotti in grado di tenere sotto controllo le infezioni da PPV in pesco, sono stati anche testati dei protocolli per la produzione e applicazione di RNAi-dsRNA. Sebbene l’agroinfiltrazione e il sistema di trasporto delle molecole siano stati semplici, veloci ed economici, l’approccio SIGS presentato qui è ancora ad uno stadio preliminare e dovrà essere esplorato in un prossimo futuro. In conclusione, in pesco l’approccio HIGS è complicato come metodo di difesa contro i virus a causa della difficoltà nell’ottenere un sistema di trasformazione efficiente. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi prodotti a base di dsRNA per il controllo delle infezioni virali, come la Sharka ad esempio, sembra essere un’alternativa interessante, ma molte fasi (metodi di produzione e trasporto su tutte) devono essere ottimizzate per poter dimostrare la loro efficacia.Since the beginning of agriculture, plant virus diseases have been a strong challenge for farming. Following its discovery at the very beginning of the '90s, the RNA interference (RNAi) mechanism has been widely studied and exploited as an integrative tool to obtain resistance to viruses in several plant species, with high target-sequence specificity. In this thesis, the major aspects of Host-induced gene silencing (HIGS), as one of the possible plant defence methods, using genetic engineering techniques have been reviewed. In particular, the use of RNAi-based gene constructs to introduce stable resistance in host plants against viral diseases, by triggering post-transcriptional gene silencing (PTGS) has been described. Recently, Spray-induced gene silencing (SIGS), consisting of the topical application of small RNA molecules (sRNAs) to plants, has been explored as an alternative tool to the stable integration of RNAi-based gene constructs in plants. Specifically, Sharka disease represents a major threat to peach production worldwide and its etiological agent, plum pox virus (PPV), is included in the Top 10 catastrophic plant virus list. With the final aim to develop strategies to induce PPV resistance in peach exploiting RNAi mechanism, both HIGS and SIGS approaches have been attempted. In particular, with the aim to stable express RNAi-inducing dsRNA against PPV in peach (HIGS strategy), the work was focused on development of in vitro protocols for the regeneration and genetic transformation suitable for this species. First of all, an overview of research on the regeneration and genetic transformation in Prunus persica L. have been reviewed and novel strategies and procedures aimed at producing transgenic peach lines have been summarized. The results achieved prove that adventitious shoot regeneration seems to be an effective strategy for this species. Even if with different regeneration efficiencies, adventitious shoot regeneration via organogenesis starting from different mature and juvenile tissues of different peach rootstocks and cultivars has been obtained. Differently, the integration of the transgene/s into the plant genome using different species of Agrobacterium and then the recovery of transformed plants is extremely difficult. In recent times, the exogenus application of RNAi-inducing dsRNA to plants (SIGS strategy) is considered a promising tool for virus defence for those plant species with high recalcitrance to genetic transformation systems, as peach. With the aim to develop RNAi-based products to control PPV infection in peach, protocols for the production and the topical application of RNAi-inducing dsRNA were also tested. Although the agroinfiltration and the molecules delivered system used have been simple, fast, and cheap, the SIGS approach presented here is at very preliminary step and alternative strategies in terms of both dsRNA production and delivery must be explored in the next future. In conclusion, HIGS strategy proves to be complicated as virus defence approach in peach plant due to the difficulty in obtaining an efficient transformation system. Thus, the development on new dsRNA-based products to control virus infections, as Sharka for instance, looks an interesting alternative, but several steps (i.e production and delivery methods) need to be developed in order to demonstrate their efficacy