Cloning and characterization of a new putative gene of coffee resistance to Hemileia vastatrix and application in assisted selection

A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma das doenças mais preocupantes para a cafeicultura mundial. A alta variabilidade genética desse fungo e, consequentemente, o surgimento de novas raças do patógeno, tem resultado na suplantação da resistência de cultivares lançadas pelos programas de melhoramento genético. Para desenvolver cultivares com resistência durável, é essencial o entendimento dos genes de resistência envolvidos e seus mecanismos moleculares de atuação na resistência. Dessa forma, nesse estudo, foi realizada a clonagem e caracterização molecular de um novo gene (Receptor Like Kinase) presente no Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2, uma das principais fontes de resistência dos programas de melhoramento. A clonagem foi realizada a partir de screening de uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), usando um gene que foi selecionado de biblioteca subtrativa entre interação compatível e incompatível de Cafeeiro-H. vastatrix. A sequência da BAC selecionada foi analisada, sendo identificado dois genes putativo para resistência do cafeeiro. Por meio de RT-qPCR, um dos genes, denominado de HdT_LRR_RLK2 (Leucine-rich repeat rececptor like kinase), apresentou pico de expressão apenas na interação incompatível, sendo esse considerado um novo gene putativo de resistência do cafeeiro a H. vastatrix. A partir desse gene caracterizado, foi desenvolvido um marcador molecular funcional, o qual foi analisado e validado em um conjunto de clones de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e, então, usados na seleção assistida (SAM). Na SAM, cafeeiros em diferentes gerações de melhoramento foram analisados com o marcador funcional desenvolvido, além de outros marcadores previamente obtidos e associados a diferentes genes de resistência a H. vastatrix. Foi utilizado marcadores SCAR, CAPS e SSR flanqueando dois locos (genes maiores) de resistência a raças I, II e patótipo 001 de H. vastatrix, previamente localizados em mapa genético, além de marcador funcional originado de outro gene clonado (CC-NBS-LRR) alocado em outra região do mapa genético. Nesse trabalho, também foram usados os marcadores CBD-Sat207 e CBD-Sat235 associados ao gene Ck1 de resistência a Coffee Berry Disease (CBD). Essa doença se encontra presente somente no continente africano, no entanto, o uso dos marcadores permite realizar melhoramento preventivo para essa importante doença. Nas gerações F 2 , F 3 e Retrocruzamento Suscetível (RCS 2 ) (Híbrido de Timor UFV 443-03 x Catuaí Amarelo IAC 64), as plantas foram genotipadas e fenotipadas com a raça II de H. vastatrix, para validação dos marcadores. As populações F 3:4 e RCS 3 foram genotipados com os marcadores validados. Foram identificados na F 3:4 cafeeiros com o genótipo AABBCCDDEe e no RCS 3 , genótipo AaBbCcD_E_, sendo que o loco A, B, C e D correspondem aos quatro locos de resistência a H. vastatrix e E ao loco de resistência a CBD. A SAM permitu a identificação e obtenção de piramidação de múltiplos genes de resistência a ferrugem e a CBD. Os genótipos identificados serão usados para avanço de geração e plantados para os testes de campo. O uso das estratégias de SAM e piramidação de genes têm potencial de obtenção de resistência duradoura à doenças, além de reduzir tempo, espaço e custo dos testes de campo, por permitirem o descarte de plantas contendo os alelos recessivos nos diferentes locos.Coffee leaf rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, is one of the most important phytosanitary problems affectin global coffee production. The high genetic variability of this fungus and, consequently, the emergence of new pathogen races, has resulted in resistance suplantation of cultivars released by breeding programs. To develop cultivars with durable resistance, it is essential to understand the genes associated with the resistance and their molecular mechanisms. Thus, in this work, a new gene (Receptor Like Kinase) present in the Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2, one of the main sources of coffee resistance, was cloned and molecular characterized. The gene cloning was performed by screening a BAC library (Bacterial Artificial Chromosomes) using a gene that was selected from a subtractive library between compatible and incompatible Coffee-H. vastatrix interaction. The sequence of the selected BAC was analyzed, and two putative genes for coffee resistance were identified. By RT-qPCR analysis, one of the genes, called HdT_LRR_RLK2 (Leucine-rich repeat recector like kinase), showed a peak expression only in the incompatible interaction. This gene was, therefore, considered a novel putative coffee resistance gene to H. vastatrix. From this characterized gene, a functional molecular marker was developed, which was analyzed and validated on a set of coffee clones bearing different resistance gene combination. The developed marker was then used in molecular assisted selection (MAS). In the MAS, coffee plants belonging to populations of different generations were analyzed with the developed functional marker, in addition to other previously obtained markers that are also associated with differents H. vastatrix resistance genes. We used SCAR, CAPS and SSR markers flanking two locus (major genes) of resistance to races I and II and pathotype 001 of H. vastatrix, previously located in a genetic map. A functional marker originated from another cloned gene (CC-NBS-LRR) and located in different locus in genetic map, was algo analyzed. In addition, we used the markers CBD-Sat207 and CBD-Sat235, which are associated with the Coffee Berry Disease (CBD) resistance gene Ck1. This disease is confined to African; however, the use of the markers allows to make a preventive breeding for this important disease. In the generations F 2 , F 3 and Susceptible Backcross (BCS 2 ) (Híbrido de Timor UFV 443-03 x Catuaí Amarelo IAC 64), the plants were genotyped and phenotyped with race II of H. vastatrix for validation of the markers. F 3 4 and BCS 3 populations were only genotyped with the validated markers. F 3:4 coffee plants with the genotype AABBCCDDEe and BCS 3 coffee plants with the genotype AaBbCcD_E_ were selected. Locus A, B, C and D correspond to the four loci of H. vastatrix resistance and E to the locus of CBD resistance. SAM allowed the identification and obtaining coffee plants with multiple genes of resistance to rust and CBD. The selected genotypes will be used to obtain the next generation e planted for field trials. The use of SAM and gene pyramidation strategies have the potential to achieve durable resistance to diseases, as well as to reduce the time, space and cost of the field trials, since they allow the disposal of plants containing the recessive alleles in the different loci.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic