Evaluation of nematicidal potential of Pycnoporus sanguineus and its proteases.

Fungos nematófagos e fungos produtores de compostos com atividade nematicida representam uma alternativa potencialmente viável para o controle da população de nematoides parasitas. Além de promover a captura de nematoides por meio de hifas especializadas ou liberação de toxinas imobilizantes, a principal característica que confere potencial nematicida a esses fungos é a produção de enzimas extracelulares, principalmente as proteases, que atuam destruindo a cutícula dos nematoides por meio de hidrólise enzimática. Diante deste contexto o presente trabalho teve como objetivo produzir, purificar parcialmente, caracterizar e avaliar a aplicação de proteases do fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02 no controle de Panagrellus redivivus. Micélios fúngicos foram obtidos através da transferência de discos de cultura do isolado previamente mantidos em meio BDA 2% (batata-dextrose-ágar), os quais foram transferidos para frascos contendo meio sólido composto por farelo de trigo acrescido de solução mineral estéril. O extrato bruto foi obtido após seis dias de incubação do fungo em BOD no escuro a 28°C. A purificação do extrato bruto se deu em duas etapas: ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. Todas as etapas de purificação foram acompanhadas por eletroforese SDS-PAGE e o perfil de proteases das amostras foi avaliado por meio de um zimograma. As enzimas parcialmente purificadas, assim como o extrato bruto, foram caracterizadas em relação ao pH, à temperatura e à influência de íons e efetores no meio de reação. Por fim, foi avaliada a atividade nematicida dos extratos e das proteases parcialmente purificadas de P. sanguineus sobre larvas de P. redivivus. Após a purificação foram obtidos dois pools com atividade proteolítica denominados pool 1 e pool 2, que obtiveram fator de purificação de 6,14 e 1,67 respectivamente. O pool 1 apresentou atividade máxima em pH 8 e 50 °C. Observou-se um aumento da atividade enzimática em presença de íons Fe 2+ enquanto que a atividade foi inibida em presença de EDTA, SDS e Zn 2+ . Já o pool 2 apresentou atividade máxima em pH 3 e 50 °C, sua atividade foi fortemente inibida por SDS. Quanto ao potencial nematicida foi observado um percentual de redução de xlarvas de P.redivivus após 24 horas equivalente a 81,5% para os micélios do fungo, 24,4% para o extrato bruto, 50,5% para o pool 1 e 41% para o pool 2. Após 48 horas de ensaio essas percentagens foram de 80,9%, 55,8%, e 61,2% e 68,8% respectivamente. Diante dos resultados, foi demostrado que o fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02, embora não seja classificado como fungo nematófago foi eficiente no controle de larvas de Panagrellus redivivus. Além das proteases ácidas já descritas na literatura, P. sanguineus quando cultivado em fermentação no estado sólido utilizando farelo de trigo como substrato, também produz ao menos uma protease alcalina. Estudos futuros sobre a produção de enzimas e metabólitos com atividade nematicida de Pycnoporus sanguineus PYC 02 são necessários para elucidar os mecanismos moleculares de atuação deste fungo como um possível agente biocontrolador.Nematophagous fungi and fungi that produce compounds with nematicidal activity represent a potentially viable alternative for controlling the population of nematode parasites. In addition to promoting the capture of nematodes by specialized hyphae or release of immobilizing toxins, the main feature which confers nematicidal potential these fungi is the production of extracellular enzymes, particularly proteases that act by destroying the cuticle of the nematode by enzymatic hydrolysis. Given this context, this study aimed to produce, purify partially, characterize and evaluate the application of Pycnoporus sanguineus PYC 02 proteases in Panagrellus redivivus control. Fungal mycelia were obtained by transferring dishes of the isolated culture previously maintained on 2% PDA medium (potato dextrose agar), which was transferred to vials containing solid medium composed of wheat bran plus sterile mineral solution. The crude extract was obtained after six days of incubation of the fungus in BOD in the dark at 28 ° C. Purification of the crude extract was given in two stages: ultrafiltration and ion exchange chromatography. All purification steps were monitored by SDS- PAGE and samples of the protease profile was assessed by a zymography. The previously purified enzymes, as well as crude extract, were characterized with regard to pH, temperature and the influence effectors and ions in the reaction medium. Finally, we evaluated the nematicidal activity of the extracts and purified proteases of P. sanguineus on P. redivivus. After purification were obtained two pools with proteolytic activity, called pool 1 and pool 2, which purification factor was 6.14 and 1.67, respectively. Pool 1 showed maximum activity at pH 8 and 50 °C. There was an increase of enzyme activity in the presence of Fe 2 + , while the enzyme was inhibited in the presence of EDTA, SDS, and Zn 2 + . On the other hand the pool 2 had maximum activity at pH 3 to 50 ° C and its activity was strongly inhibited by SDS. Regarding the potential nematicidal activity, it was observed the reduction percentage of P.redivivus, after 24 hours equivalent to 81.5% for the mycelia of fungi, 24.4% for the crude extract, 50.5% for pool 1 and 41% for pool 2. After 48 hours of testing, these percentages were 80.9%, 55.8% and 61.2% and 68.8%, respectively. Given the results, xiiit was shown that the fungus Pycnoporus sanguineus PYC 02, although it is not classified as nematophagous fungus was effective in controlling Panagrellus redivivus larvae. Besides the acidic proteases described in the literature, P. sanguineus when grown in solid state fermentation using wheat bran as substrate, also produces at least one alkaline protease. Future studies on the production of enzymes and metabolites with nematicidal activity by Pycnoporus sanguineus PYC 02 are needed to elucidate the molecular mechnisms of action of this fungus as a potential biocontrol agent.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio