Comparative analysis of excitation-contraction coupling properties including intracellular Ca2+ handling mechanisms and Ca2+ buffering by troponin proteins in the left and right ventricular myocytes from rats

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의과학과, 2022.2. 김성준.Despite distinctive functional and anatomical difference, a precise understanding of the cardiac interventricular difference in excitation-contraction (E-C) coupling mechanisms is still lacking. Here, we compared the results from the right and left cardiomyocytes (RVCM and LVCM) of rats. Whole-cell patch clamp technique, IonOptix system and fura-2 fluorimetry were used to measure electrical properties (action potential and ionic currents), single cell contractility and cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i), respectively. Myofilament proteins were analyzed by Immunoblotting. RVCMs showed significantly shorter action potential duration (APD) and higher density of transient outward K+ current (Ito). However, the triggered [Ca2+]i change (Ca2+ transient) was not different, while the decay rate of the Ca2+ transient was slower in RVCM. Although the relaxation speed was also slower, the sarcomere shortening amplitude (ΔSL) was smaller in RVCM. The SERCA activity was approximately 60% lower in RVCM, partly responsible for the slower decay of the Ca2+ transient. Immunoblot analysis revealed lower expression of the cardiac troponin complex (cTn) in RVCM, implying a smaller Ca2+ buffering capacity (κS ), which was proved by in situ analysis. The introduction of the newly found 0.65-fold cTn along with the 1.31-fold Ito and 0.40-fold SERCA into a mathematical model of rat LVCM reproduced the similar Ca2+ transient, slower Ca2+ decay, shorter APD and smaller ΔSL of RVCM. Taken together, we first show the lower expression of cTn proteins in the RVCMs, which gives a clue to explain the interventricular difference in the E-C coupling kinetics.심장의 좌·우심실은 구조적, 기능적으로 서로 다른 특성을 보인다. 우심실은 좌 심실에 비해 낮은 압력에 노출되어 있으며, 심실 내 압력이 빠르게 증가하여 폐동 맥보다 높아진다. 이로 인해 혈역학적 차이를 보이며 압력-용적 곡선 상 좌심실과 상이하다. 하지만 심실을 구성하는 세포인 좌·우심근세포의 생리적 특성에 대한 연 구는 부족하며, 특히 두 심근세포의 흥분-수축 연결 이론 관점의 차이는 알려진 것이 거의 없다. 본 연구에서는 백서의 좌·우심실을 구분하여 그 심근세포를 분리 한 뒤, 흥분-수축 연결의 각 단계의 생리 현상을 기록하고 비교 연구 하였다. 우심근세포의 생리 특성을 면밀히 연구하기 위해 흥분-수축 연결의 첫 단계인 활동전압과 이온통로의 전류를 전세포 팻취클램프 기법을 이용하여 좌심근세포와 비교하였다. 우심근세포는 좌심근세포에 비해 모든 구간에서 활동전압이 확연히 짧았다. 우심근세포에서 transient outward K+ 전류의 크기가 좌심근세포에 비해 컸 으며, 이로 인한 빠른 재분극으로 인해 우심근세포의 활동전압이 짧았다. 반면 두 심실근세포에서 전압의존성 내향성 칼슘 전류의 크기는 차이가 없었다. 짧은 활동 전압 기간과 동일한 칼슘 전류의 크기로 인해 세포 내로 유입되는 칼슘의 양은 우심 근세포가 좌심근세포에 비해 적을 것으로 예상하였고, 활동전압 고정법과 수학적 모델의 계산을 통해 이를 확인하였다. 흥분-수축 연결의 “흥분”에 해당하는 활동전압과 수축 현상의 매개체인 칼슘의 조절 현상을 비교하기 위해, fura-2 형광 염료를 이용해 전기적 자극으로 인한 세포 내 칼슘 농도 변화 (calcium transient)를 측정하였다. 좌·우심근세포의 칼슘 농도 변 화의 크기 (Δ[Ca2+]i)는 동일한 반면, 우심근세포의 칼슘 농도 감소 (decay) 속도가 확연히 느렸다. 우심근세포는 특징적인 짧은 활동전압으로 인해 칼슘 유입이 적은데도 불구하 고 세포 내 칼슘 농도의 변화 크기는 좌심실과 동일하였다. 이 현상은 고전적인 흥 분-수축 연결과 근소포체의 칼슘 유리 기전으로 설명 할 수 없는 현상이기 때문에, 본 연구에서 세포 내로 유입된 칼슘이 결합할 내인성 칼슘 완충력이 좌심근세포보다 적다는 가설을 수립하였다. 따라서 심근세포의 주요 내인성 칼슘 완충 단백인 tro- ponin 복합체의 발현양을 비교하였으며, 우심근세포에서 troponin C (TnC), troponin I (TnI), troponin T (TnT)의 발현량이 좌심근세포의 70% 수준인 것을 관찰했다. 실제 유입된 칼슘이 세포 내인성 칼슘 완충 단백에 결합하는 현상을 정량적으로 비교하기 위해 팻취클램프와 칼슘 이미징 기법을 동시에 사용하여 칼슘 결합 비율을 측정하 였다.그 결과 동일한 양의 칼슘이 세포 내로 유입 되도 내인성 완충단백에 결합하는 칼슘의 양이 우심근세포에서 더 적음을 관찰 하였다. 따라서 본 가설을 통해 우심근 세포의 활동전압과 칼슘 조절이 좌심근세포와 다름을 규명하였다. 반면, 우심근세포의 칼슘 농도 감소가 느린 현상을 규명하기 위해, 좌·우심근세 포 내 칼슘 제거 기전을 측정하여 비교했다. 두 심근세포의 Na+-Ca2+ exchanger (NCX)와 plasma membrane Ca2+ ATPase (PMCA)에 의한 칼슘 제거 속도는 큰 차이 가 없었으나, sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA)는 그 활성이 좌심근세 포에서 더 우세했다. 따라서 우심근세포의 느린 칼슘 감소 속도는 SERCA의 활성이 좌심근세포에 비해 더 낮기 때문임을 규명하였다. Troponin 복합체는 내인성 칼슘 완충 단백이며 동시에 근세포의 수축 단백질 이다. Troponin 복합체의 절대 양이 적은 우심근세포에서 전기적 자극으로 유도된 근절 길이 수축을 관찰하였으며, 우심근세포의 근절 길이 변화 (ΔSL)가 좌심근세 포보다 짧은 것을 알 수 있었다. 또한 우심근세포의 근절 길이 변화의 이완속도가 좌심실근보다 느린 현상이 관찰되었는데, 이는 우심근세포의 칼슘 감소 속도가 느 리기 때문이라고 사료된다. 좌심근세포와 비교하여, 우심근세포의 특이적인 짧은 활동전압과 적은 칼슘 유 입량이 관찰되었다. 하지만 전기적 자극에 의한 세포 내 칼슘 농도의 변화 폭 (Δ [Ca2+]i)은 동일하였다. 이는 세포 내인성 칼슘 완충 단백인 troponin 복합체가 우 심근세포에서 적게 발현되어 있기 때문이며, 이로 인해 근세포의 근절 길이 변화 (ΔSL)도 좌심근세포보다 짧다. 또한 칼슘 제거 기전인 SERCA의 활성이 우심근세 포에서 느리기 때문에 세포 내 칼슘 농도 감소 속도가 느릴 뿐 아니라 근절 길이의 이완 속도도 느린 것을 관찰하였다. 가설을 검증하기 위해 측정한 실험 결과를 심근 세포의 이온통로 전류와 칼슘 조절, 그리고 수축력을 도식한 수학적 모델에 반영하 였다. 그 결과 세포 내 칼슘 농도 변화와 근절 길이 변화에서 동일한 양상을 관찰 할 수 있었다. 좌심근세포와 비교하여 우심근세포의 낮은 troponin 발현과 이로 인한 적은 내 인성 칼슘 완충력, 그리고 느린 SERCA는 우심근세포 흥분-수축 연결의 특성임을 규명하였다. 좌심실에 비해 우심실의 낮은 압력과 느린 이완속도는 우심실의 해부 학적 구조와 혈역학적 환경에 더하여 본 연구에서 규명한 우심근세포의 특성에 의해 기인하는 것으로 사료된다.국문초록 i 제1장 서론 7 1.1 좌우심실의차이 7 1.2 심장의 흥분-수축 연결과 매개체로의 칼슘 12 1.3 심근세포 내 칼슘 완충 15 제2장 연구목표 18 제3장 연구방법 20 3.1 연구재료 20 3.1.1 동물 20 3.1.2 심근세포 분리 20 3.1.3 단백질 분리 21 3.2 실험방법 22 3.2.1 전기 생리 22 3.2.2 심근세포 기능 평가 22 3.2.3 면역블로팅법 23 3.2.4 칼슘 완충력의 측정-이론 24 3.2.5 칼슘 완충력의 측정-실험 27 3.2.6 칼슘 완충력의 측정-계산 29 3.2.7 접근 가능한 세포 부피 측정 30 3.2.8 세포 내fura-2농도 측정 31 3.2.9 Fura-2비율과 세포 내 칼슘 농도의 변환 32 3.2.10 세포 내 fura-2의 해리상수 측정 36 3.2.11 칼슘 제거 기전의 측정 39 3.2.12 실험 용액 및 시약 40 3.2.13 실험 결과의 통계적 처리 41 3.3 수학적 모델을 이용한 가설 검증 42 3.3.1 활동전압 시뮬레이션 42 3.3.2 세포 내 칼슘과 근절 길이 변화 시뮬레이션 43 제4장 실험결과 49 4.1 활동 전압의 측정 49 4.1.1 막 축전 용량의 비교 49 4.1.2 활동 전압의 비교 50 4.2 이온통로 전류의 측정 55 4.2.1 K+ 전류의 비교 55 4.2.2 Ca2+ 전류의 비교 59 4.3.3 우심근세포의 활동 전압 시뮬레이션과 칼슘 유입량 측정 62 4.3 세포 내 칼슘 농도 변화 65 4.3.1 세포 내 칼슘 농도 변화의 분석 65 4.3.2 칼슘 제거 기전의 비교 70 4.3.3 우심근세포의 낮은 SERCA 활성의 분자적 기전 74 4.3.4 근필라멘트의 칼슘 결합 단백질 발현량 비교 76 4.3.5 칼슘 완충능의 비교 80 4.4 근절 길이 측정 86 4.4.1 근절 길이의 변화와 수축-이완 양상 87 4.4.2 자극속도와 근절 길이의 변화 양상 90 4.4.3 칼슘 민감도 차이 92 4.4.4 칼슘농도 변화와 근절 길이 변화의 시뮬레이션 95 제5장 고찰 101 5.1 활동전압과 세포 내 칼슘 농도 변화의 불일치 102 5.2 두 심근세포의 SERCA 활성의 차이 106 5.3 우심근세포의 수축력 108 5.4 병태생리적 의미 113 제6장 결론 116 ABSTRACT 137박