방선균 유래 신규 자가포식 조절 펩타이드의 발견과 Tripartilactam 및 Lydiamycin A에 대한 구조적 재해석

학위논문 (박사) -- 서울대학교 대학원 : 약학대학 약학과, 2021. 2. 오동찬.천연물 신약 개발 연구의 기반이 되는 선두 물질의 발견을 위하여 곤충 유래 방선균이 생산하는 이차대사물질의 발견 및 구조 결정 연구를 진행하였다. 특히 방선균이 생산하는 새로운 펩타이드 물질에 대한 연구 (파트 A)와 이미 보고된 기지물질의 구조적 오류를 찾고 이를 수정하는 연구 (파트 B)를 수행하였다. 파트 A. 방선균이 생산하는 새로운 펩타이드 타입의 물질. 5가지 새로운 펩타이드 물질인 acidiphilamides A-E (1-5) 는 이미 보고된 L-isoleucinamide와 L-valinamide와 함께 산성 토양 유래 호산성 방선균 Streptacidiphilus rugosus AM-16으로부터 발견되었다. 1-5 물질의 구조는 phenylalaninol 혹은 methioninol을 포함하며 C3~C5 acyl chain을 가지는 변형된 세 아미노산으로 구성된 펩타이드 물질들이며 이는 핵자기공명을 통한 분광분석 (NMR) 및 분광학적 질량분석을 통해 밝혀졌다. 아미노산들의 절대입체구조는 advanced Marfey’s method 와 GITC (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate) 유도체화 반응과 LC/MS 분석을 통해 밝혀냈다. Acidiphilamide A와 B는 희귀 방선균인 Streptacidiphilus 속에 속하는 균주에 의해 만들어지는 최초로 밝혀진 이차대사물질이며 이 물질들이 HeLa 세포에서 autophagy flux를 효과적으로 억제하는 동시에 proteasome activity를 억제하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이 물질들은 주로 세포의 autophagy 마지막 과정의 autophagosome-lysosome의 융합과정을 억제하는 역할을 하는 것으로 보인다. Pentaminomycins C-E (6-8)는 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 샘플의 내장에서 분리된 Streptomyces 종의 GG23 균주 배양액으로부터 분리되었다. Pentaminomycin 물질들은 분광학적 1D와 2D NMR 분석 및 질량분석을 통하여 N5-hydroxyarginine을 포함하는 고리형 펩타이드 물질이라는 것을 규명하였다. 각 아미노산들의 절대입체구조는 Marfey’s method와 비리보솜 펩타이드 (NRP) 의 생합성 유전자 (BGC) 정보분석을 통하여 결정하였다. 생합성 유전자에 대한 자세한 분석을 통해 모듈 1의 NRPS adenylation domain 이 낮은 특이성을 가지고 있기 때문에 물질 6-8의 구조적 다양성이 발생하는 것으로 확인하였고 또한 거대 고리화 과정을 진행하는 효소가 일반적인 효소가 아니고 특이한 페니실린 결합 단백질 타입의 thioesterase (TE) 라는 것을 알게 되었다. 뿐만 아니라 pentaminomycin C 와 D (6 과 7) 는 autophagy를 유도하는 활성을 가지고 있으며 산화적 스트레스에 대한 보호작용 활성이 있음이 세포 수준에서 확인되었다. 파트 B. 이미 보고된 기지물질의 구조적 오류 및 수정. Tripartilactam (9) 은 거대고리 구조를 가진 락탐계열 천연물로 원래 희귀한 골격인 [18,8,4]-삼고리 구조로 보고되었던 물질이다. 그러나 [18,6,6]-삼고리 구조 골격을 가진 niizalactam C (10) 가 tripartilactam의 대체 구조로 보고된 2015년 이래로 해당 구조의 타당성에 대한 논의가 있었다. 따라서 이에 대한 확실한 규명이 필요하다고 생각되었고 NMR 분광분석 결과에 대한 종합적인 재조사와 13C-13C COSY NMR 실험을 통한 13C-13C 직접 커플링을 확인하여 tripartilactam 의 구조가 niizalactam C 와 동일하다는 것을 명백하게 했다. 이에 덧붙여서 tripartilactam 을 생산하는 생합성 균주에 대한 전장유전체 분석 및 유전자 정보 분석과 돌연변이화 분석을 통해 물질의 생합성 경로를 확인할 수 있었다. 이를 통해 확인된 생합성 경로의 특징은 type I polyketide synthase 모듈들 중에서 하나가 반복적으로 사용되며 PKS 후과정으로 자발적인 [4+2] 고리첨가 반응을 통하여 전구물질인 sceliphrolactam에서 tripartilactam으로 생합성 된다는 것이다. Lydiamycin A (11) 는 이미 보고되었던 Streptomyces 로부터 생산된 piperazic acid 모핵을 가지고 있는 고리형 펩타이드 물질이다. Lydiamycin A의 절대입체구조는 여러 차례 유기합성을 통해 규명하려는 시도들이 있었지만 완전히 규명되지 않았다. 이에 따라 lydiamycin A (11) 의 입체구조를 확실히 규명하기 위하여 advanced Marfey’s method, 화학적 유도체화 반응 및 양자역학 기반의 컴퓨터 분석 등의 방법을 진행했고 결국 구조의 수정과 절대입체구조의 결정을 완료할 수 있었다. 또한 Lydiamycin A (11) 는 세포수준에서 약한 항결핵활성을 가지고 있음도 확인되었다.During my doctoral course, my research works were concentrated to the structure determination of secondary metabolites derived from insect associated actinomycetes for drug discovery. Especially, my study was divided into discovery of new peptide type compounds from actinomycetes (Part A) and reinvestigation of inaccurate structures of already reported compounds (Part B). Part A. New Peptides Modulating Autophagy from Actinomycetes Five new tripeptides, acidiphilamides A-E (1-5), were discovered along with two previously reported compounds, L-isoleucinamide and L-valinamide, from Streptacidiphilus rugosus AM-16, an acidophilic actinobacterium isolated from acidic forest soil. The structures of 1-5 were elucidated as modified tripeptides bearing phenylalaninol or methioninol fragments with C3~C5 acyl chains based mainly on NMR and mass spectroscopic data. The absolute configurations of the amino units were established by advanced Marfey’s method and GITC (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-d-glucopyranosyl isothiocyanate) derivatization followed by LC/MS analysis. Acidiphilamides A and B (1-2), the first secondary metabolites isolated from the rare actinobacterial genus Streptacidiphilus, significantly inhibited autophagic flux but not proteasome activity in HeLa cells. These compounds appeared to block mainly the autophagosome-lysosome fusion step in the late stage of cellular autophagy. Pentaminomycins C–E (6–8) were isolated from the culture of the Streptomyces sp. GG23 strain from the guts of the mealworm beetle, Tenebrio molitor. The structures of the pentaminomycins were determined to be cyclic pentapeptides containing a modified amino acid, N5-hydroxyarginine, based on 1D and 2D NMR and mass spectroscopic analyses. The absolute configurations of the amino acid residues were assigned using Marfey’s method and bioinformatics analysis of their nonribosomal peptide biosynthetic gene cluster (BGC). Detailed analysis of the BGC enabled us to propose that the structural variations in 6–8 originate from the low specificity of the adenylation domain in the nonribosomal peptide synthetase (NRPS) module 1, and indicate that macrocyclization can be catalyzed noncanonically by penicillin binding protein type thioesterase (PBP-type TE). Furthermore, pentaminomycins C and D (6 and 7) showed significant autophagy-inducing activities and were cytoprotective against oxidative stress in vitro. Part B. Reinvestigation of the Structures of Tripartilactam and Lydiamycin A Tripartilactam (9) is a natural macrocyclic lactam originally reported to have a unique [18,8,4]-tricyclic framework. However, the validity of this structure has been contested since niizalactam C (10) bearing a [18,6,6]-tricyclic skeleton was proposed as an alternative structure in 2015. In this study, a comprehensive reinvestigation of NMR spectroscopic data and a 13C-13C COSY NMR experiment identified direct 13C-13C coupling, thus leading to the unequivocal revision of the structure of tripartilactam as niizalactam C (10). In addition, whole-genome sequencing analysis of the tripartilactam-producing bacterial strain and subsequent bioinformatics and mutagenesis analyses identified its biosynthetic pathway, which probably utilizes one of the type I polyketide synthase (PKS) modules iteratively during its biosynthesis and exhibits spontaneous [4+2] cycloaddition from the precursor compound, sceliphrolactam, in the post-PKS process. Lydiamycin A (11) is a previously reported piperazic acid-bearing cyclic peptide from Streptomyces. The absolute configuration of lydiamycin A has not been fully determined despite multiple total syntheses being reported. The absolute configuration of 11 was reinvestigated by the advanced Marfey’s method, chemical derivatization, and quantum mechanics-based computational analysis, eventually resulting in a structural revision and establishment of the complete configuration. Lydiamycin A (11) displayed weak antituberculosis activity in vitro.Abstract in English I List of Contents V Part A. New Peptides Modulating Autophagy from Actinomycetes I. Introduction 2 II. Acidiphilamides A-E, Modified Peptides as Autophagy Inhibitors from an Acidophilic Actinobacterium, Streptacidiphilus rugosus 4 III. Pentaminomycins C–E: Cyclic pentapeptides as autophagy inducers from a mealworm beetle gut bacterium 28 Part B. Reinvestigation of the Structures of Tripartilactam and Lydiamycin A I. Introduction 56 II. Structure Revision and the Biosynthetic Pathway of Tripartilactam 60 III. Structural Revision of Lydiamycin A by Reinvestigation of the Stereo-chemistry 79 Summary 103 References 107 Appendix: NMR Spectroscopic Data 119 Abstract in Korean 134 Publication List 140 Permissions for Republication of the Published Papers in Thesis 144 Acknowledgements 148Docto