Development of novel biomaterials for regenerative endodontic treatment

Les Traitements Endodontiques Régénératifs (TER) des dents immatures sont une alternative au traitement endodontique classique. Ces procédures s’appliquent après une désinfection et une préparation mécanique du canal radiculaire. Suite au saignement du périapex le sang remonte dans le canal en créant un caillot. Après sa réorganisation en un tissu conjonctif vascularisé, il peut remplacer le tissu endommagé et poursuivre l’apexogénèse. Les résultats des TER sont encourageants mais pas constants dû à une désinfection incomplète, une variabilité des cellules et des facteurs de croissance du sang, des propriétés mécaniques faibles et une dégradation rapide du caillot. Afin d’améliorer ces procédures, cette thèse a thèse a été conduite sur trois axes en ayant pour objectif de développer deux biomatériaux, un résorbable sous la forme de gel injectable et un non-résorbable.1)Mise au point et caractérisation d’un hydrogel à base de Fibrinogène et de sang.Afin d’améliorer les propriétés mécaniques et biologiques du caillot sanguin nous l’avons enrichi en fibrinogène. Du sang humain a été mixé avec du Fibrinogène(Fbg) dilué dans du milieu de culture cellulaire. Plusieurs concentrations des composants ont été testées. Les propriétés mécaniques d’hydrogels et de la pulpe dentaire ont été mesures par microscopie à force atomique et des mesures rhéologiques de cisaillement à faible amplitude. Le taux de dégradation et de gonflement des hydrogels a été évalué. La survie et la prolifération cellulaire ont été évaluées par la microscopie à fluorescence. Le changement de la structure fibrillaire de l’hydrogel a été étudié par la microscopie multiphotonique (MPM). Pour évaluer les propriétés angiogéniques du gel à différentes concentrations de Fbg, un modèle ex vivo basé sur l’utilisation des anneaux de l’aorte de rats a été utilisé. Avec cette première série d’expériences nous avons défini un hydrogel avec des propriétés biomécaniques similaires à la pulpe dentaire, prometteuses pour son utilisation dans le cadre de la revitalisation pulpaire.2)Comparaison histologique entre l’hydrogel à base Fbg-sang et la pulpe dentaire humaine. Nous avons injecté l’hydrogel Fbg-sang avec des cellules de la pulpe dentaire (DPCs) dans la racine de dents humaines extraites et observé le comportement cellulaire et la maturation du tissu néoformé après 4 semaines ex vivo, en comparant l’histologie de l’hydrogel avec celle de la pulpe dentaire humaine. La caractérisation du tissu néoformé, ainsi que de la pulpe de dents saines a été réalisée par: Histologie classique, immunohistochimie pour détecter des marqueurs périvasculaires (CD31, αSMA et Collagène de type IV) et la MPM.Le caractère du tissu obtenu à l’intérieur de la racine est un tissu de réparation présenté sous forme d’un réseau fibreux contenant des cellules. Ce tissu a une architecture semblable à celle de la pulpe dentaire en vue de la disposition cellulaire et de la formation des nouveaux vaisseaux sanguins.3) Nous avons étudié les propriétés biologiques d’un matériau non résorbable et bioactive qui sont dues à la fonctionnalisation de sa surface par un revêtement organique-inorganique. Ce matériau pourrait être utilisé comme une matrice dans TER. L’effet du revêtement dans les DPCs a été évalué in vitro(MTT, ALP, RT-qPCR )et ex vivo en combinant l’utilisation du gel de Fbg-sang avec le matériau bioactif à l’intérieur de la racine. Le tissu formé à l’intérieur du canal a été évalué par histologie classique(He-Eo) et MPM. Les résultats montrent que les surfaces avec revêtement bioactive stimulent la maturation et la différenciation cellulaire. Le modèle ex vivo détecte la formation d’un tissu fibreux organisé et attaché à la surface du matériau avec revêtement qui suggère la bio-intégration au tissu formé par le gel.Les biomatériaux développés au cours de cette thèse sont prometteurs et originaux pour leur application dans le domaine du traitement régénératif endodontique.Regenerative Endodontic Treatment (RET) of necrotic teeth is an alternative to conventional endodontic treatment. Clinical protocol for RET is based on evoked periapical bleeding trough root apex, followed by blood clot formation. After reorganization of the clot a vascularized connective tissue could be formed to replace the damaged pulp and continue apexogenesis.RET on immature necrotic teeth gave encouraging results but they are not consistent. Lack of reproducibility may be due to incomplete root canal disinfection; variability of cells and growth factors of blood and poor mechanical properties and rapid degradation of the blood clot. To improve these procedures, the objective of this thesis was to develop two types of biomaterials, one resorbable - presented like an injectable hydrogel and one non-resorbable bioactive material.The thesis was conducted on 3 main axes: 1) Development and characterization of an Fibrinogen-blood contained hydrogel; 2) Histological comparison between the fibrinogen-blood gel and human dental pulp and 3) Bioactive non resorbable materialIn the first part of the thesis we mixed different concentration of Fibrinogen (Fbg) and of peripheral whole blood to obtain different Fbg-blood hydrogels. Atomic Force Microscopy and small amplitude oscillatory shear rheological measurements were used to characterize their mechanical properties. Swollen and degradation rate were evaluated by weigh changes. Biological properties were evaluated by following dental pulp cells (DPCs) behavior after incubation in the gel up to 3 weeks. Angiogenic potential was assessed by ex vivo rat aortic ring assay. Finally we selected the hydrogel composition which presents biomechanical properties close to human dental pulp with that represents the best environment for DPCs proliferation and possess angiogenic properties.In the second stage, the gel was injected inside endodontically pre-treated root canals for 4 weeks and cultured under laboratory conditions. Characterization of the newly formed tissue was made by histology (H-E and Masson Trichrome), immunohistochemistry (IHC) for perivascular markers detection (CD31, αSMA and Collagen IV) and multiphoton microscopy (MPM: 2- photon excited fluorescence (2-PEF) and second harmonic generation (SHG)). Comparison with human dental pulp was performed. An extracellular matrix mostly composed by autofluorescent fibers (elastin or fibronectin) was detected. Fibers and cell disposition are similar to dental pulp. Positive marked zones to CD31, αSMA and Col IV suggests neo-vessels formation.The following part of the thesis consists on the evaluation of biological properties of a bioactive non resorbable material that could be used as a scaffold for RET. DPC proliferation and differentiation on functionalized non resorbable material surfaces was proved by biological tests (MTT, ALP, RT-qPCR). Surface of the bioactive non resorbable material enhances DPCs maturation and differentiation.This material was also placed inside root canal in vitro and ex vivo. For the in vitro model we injected DPCs after the placement of a bioactive non resorbable material inside the root canal of extracted human teeth. For the ex vivo model functionalized or non-functionalized non resorbable scaffold were placed inside root canals or plastic tips after Fbg-blood gel injection. Samples were incubated for 4 weeks and analyzed by scanning electron microscopy (SEM), multiphoton microscopy (MPM) and classical histological staining (H-E). Bio-integration of functionalized non resorbable scaffold with newly formed tissue and organized fiber formation with a longitudinally disposition was proved by histology and MPM.Developed biomaterials and models show encouraging results, placing them as original approaches in regenerative endodontic field. Next stages for validation of obtained results concerns in vivo application of novel biomaterials with a farther finality of establishment of clinical protocols