Microscopie optique 3D pour la caractérisation sans marquage des cellules immunitaires

L’imagerie des cellules biologiques est dominée par la microscopie de fluorescence, comme elle procure les meilleurs contraste et résolution. Cependant, marquer les échantillons avec des fluorophores a aussi des inconvénients, comme la photo-toxicité et un temps d’utilisation limité des fluorophores. Au contraire, les techniques d’imagerie sans marquage sont moins résolues mais ne souffrent pas de ces inconvénients, ce qui les rend particulièrement attractives pour les applications biomédicales. De nombreux processus immunologiques impliquant des cellules en solution bénéficieraient grandement de techniques de caractérisation sans marquage pour développer de nouveaux outils de diagnostique. Dans ce contexte, la méthode sans marquage actuellement la plus résolue basée sur la détection de lumière diffractée est la microscopie tomographique diffractive (TDM). Elle a jusqu’à présent uniquement été utilisée en configuration de transmission, qui souffre d’une résolution axiale nettement dégradée par rapport à la résolution transverse. Dans ce manuscrit, nous présentons à notre connaissance pour la première fois la caractérisation de cellules par TDM en géométrie de réflexion. Cette configuration est plus délicate à implémenter du fait du niveau de signal plus faible et d’une procédure de normalisation en phase plus complexe du jeu de données. Ayant résolu ces difficultés, nous montrons que cette géométrie procure la meilleure résolution si c’est la reconstruction du contour des cellules qui est visée. Nous validons expérimentalement cette approche sur différentes cellules immunitairesImaging of biological cells is dominated by fluorescence microscopy, as it provides the best contrast and resolution. However, tagging the samples with fluorophores also have some drawbacks, like phototoxicity and photobleaching. Moreover, it usually requires an additional sample preparation step. On the other hand, label free microscopy techniques are less resolved but do not suffer from these drawbacks, which make them particularly attractive for bio-medical applications. Numerous immunological processes involving cells in solution would highly benefit from a label free characterization technique to develop new diagnosis tools. In this context, presently the best resolved label free imaging tool is tomographic diffractive microscopy (TDM). It consists of shining a coherent beam on the sample with different illumination angles, detecting the complex (amplitude and phase) scattered field, and reconstructing in 3D the sample from the data set. It has up to now only been used in transmission geometry, and suffers from a poor axial resolution compared to the transverse one. In this work, we present for the first time (to our knowledge) the characterization of cells with TDM in reflection geometry. This configuration is more difficult to implement due to the lower level of scattered signal and the more complex phase normalization of the data set required. Having solved these issues, we show that it provides the best resolution if the contour reconstruction of the cells is targeted. We validate experimentally the technique on different immunological cells, with potential application to detect important processes like immunological synapse formation or phagocytosi