Study of ORAI protein remodeling with CRISPR and quantitative microscopy

L’entrée capacitive de calcium (Ca2+), appelée SOCE en anglais (store operated Ca2+ entry) représente une entrée d’ions Ca2+ dans la cellule consécutive à la vidange des stocks calcique réticulaires. Ce processus constitue l’un des mécanismes d’entré majeure de Ca2+ dans les cellules non-excitables. L’importance physiologique de ce processus est soulignée par la gravité des syndromes induits par des mutations des canaux responsables du SOCE : le syndrome sévère d’immunodéficience combinée induit par des mutations de types perte de fonction du SOCE et les syndromes d’agrégation tubulaire myopathique (TAM) et de Stormorken induit pas des mutations de type gain de fonction du SOCE. Le SOCE résulte de l’interaction de deux familles de protéines appelées STIM (Stromal interaction protein, 1,2) localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et ORAI (1-3) situées dans la membrane plasmique. Le processus classique d’apparition du SOCE dans les cellules peut être décrit de la sorte : La protéine STIM1, qui possède des motifs EF-hand sensible au Ca2+ dans la lumière du RE, détecte une diminution de la concentration en Ca2+. En réponse, la protéine STIM subit un changement conformationnel qui conduit à son oligomérisation et sa translocation au niveau des jonctions membrane plasmique – RE. Les protéines STIM vont ensuite interagir, regrouper et activer les protéines ORAI1 qui forment le canal appelé Ca2+-release activated Ca2+ (CRAC) aboutissant à la production du SOCE. Cependant, de nombreuses publications ont démontré l’implication des autres isoformes des protéines STIM et ORAI dans ce processus. De manière intéressante, l’intervention des protéines STIM2 et ORAI2/3 dans le mécanisme du SOCE permet de moduler le signal produit et ainsi de réguler finement les effets physiologiques de l’entrée de Ca2+ dans les cellules. En particulier, notre laboratoire a démontré que les canaux hétéromériques formés par les protéines ORAI1 et ORAI3 définissent un "interrupteur" oncogénique dans les cellules cancéreuses prostatiques permettant l’apparition d’un phénotype plus agressif. L’étude des mécanismes amenant à la formation de ces canaux hétéromériques est complexe en raison des limites des techniques à disposition. Par exemple, la plupart des moyens d’études reposent sur des systèmes de surexpression ou de sous expression, qui ne permettent pas de supprimer totalement l’expression des protéines endogènes. La présence de ces protéines endogènes rend difficile l’interprétation des résultats obtenus. Le but de cette thèse était donc d’utiliser des techniques de pointe pour étudier les mécanismes d’association des protéines ORAI. Ainsi, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 afin de générer des cellules doubles knockout (KO) pour les protéines ORAI1 et ORAI3. Ces cellules, KO pour ORAI1 et ORAI3 ont été utilisées pour réaliser des expériences de microscopie quantitative. Nous avons notamment ré-exprimé des versions fluorescentes des protéines ORAI1 et ORAI3 dans ces cellules avant de réaliser des expériences de mesure de temps de vie de fluorescence via la technique de FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer). Cette technique nous a permis de suivre l’évolution des interactions entre les protéines ORAI1 et ORAI3 lors de différentes stimulations cellulaires. De la sorte nous avons pu montrer que l’interaction entre les protéines ORAI1 et ORAI3 est dynamique en fonction de la stimulation appliquée. De plus, nous avons tiré profit des cellules KO générées afin d’étudier le rôle des protéines ORAI1/3 et du SOCE dans les lignées HEK-293 et PC3. Nous avons ainsi démontré que, dans les cellules HEK, la protéine ORAI1 et le SOCE jouent un rôle limité dans le maintien de leur physiologie, alors que dans les cellules PC3, ORAI1 et ORAI3 sont importantes pour le maintien du phénotype migratoire de ces cellules.The store operated calcium (Ca2+) entry (SOCE) represents the entry of Ca2+ through the cell’s plasma membrane consecutive to an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ store depletion. This process is described as one of the main calcium (Ca2+) pathway in the cells. Its importance is highlighted by the severe syndromes induced by loss or gain of function mutation of its constituent named severe combined immunodeficiency (SCID) and tubular aggregate myopathy (TAM)/Stormorken syndrome (STRMK) respectively. SOCE is the result of interaction between two families of proteins, the ER residing protein family Stromal interaction molecule (STIM 1&2) and the plasmalemmal proteins called ORAI (1-3). The classic molecular choreography of SOCE activation is described as follow: a drop in ER-Ca2+ content is detected by the EF-hand domain present in the STIM protein. Following ER Ca2+ depletion, STIM protein oligomerize and translocate to ER- plasma membrane (PM) junctions where they bind and activate ORAI1 composed channel called Ca2+ release activated Ca2+ channel providing SOCE. Interestingly, it appears that this choreography is much more complex than initially thought with the involvement of other STIM and ORAI isoforms (STIM2 and ORAI2,3). The involvement of these isoforms affects the properties of SOCE by modulating its Ca2+ signature resulting in different cellular answers. Especially, it was shown that heteromeric channels composed of ORAI1 and ORAI3 protein are defining an oncogenic switch in prostate cancer cell lines that lead to the more aggressive phenotype. However, the study of the mechanisms leading to the creation of ORAI1/3 channels at the expanse of ORAI1-only channels is problematic due to technical limitations. For example, most of investigations are performed in overexpression or downregulation system where endogenous protein are still present and might blur the results of experiments. The goal of this PhD was to use high end techniques in order to study the mechanisms of ORAI1/3 interactions without facing the limitations mentioned above. Specifically, we implemented and used CRISPR/Cas9 technique to generate double knockout (KO) cell lines for ORAI1 and 3 proteins. We used these “ORAI1/3 free cells” to perform quantitative microscopy experiments. Specifically, we expressed fluorescently tagged ORAI1 and ORAI3 proteins and performed FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer) experiments enabling us to follow their association process in answer to different stimulations. We thus demonstrated that the association between ORAI1 and ORAI3 is a dynamic process in the cells. Additionally, we took advantage of these KO cell lines to study the role of ORAI1/3 protein and SOCE in HEK-293 and PC3 cells physiology. We thus demonstrated that ORAI1 protein and SOCE only presented a limited role in the maintenance of HEK-293 physiology, while ORAI1 and ORAI3 are important to maintain migrative properties of the cancerous PC3 cells